Sviluppo e unificazione di metodi per l'analisi e la standardizzazione di preparati di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione a fase inversa (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

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Pihtar Anatoly Vasilyevich. Sviluppo e unificazione di metodi per l'analisi e la standardizzazione di preparati di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione a fase inversa (RP HPLC): tesi. Candidato di Scienze farmaceutiche: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Luogo di protezione: Accademia Medica di Mosca "].- Mosca, 2005.- 139 pp.: Il.

Contenuto per la tesi

CAPITOLO 1. Revisione della letteratura 11

1. Il ruolo dell'insulina nel trattamento del diabete mellito 11

2. Biosintesi e azione biologica dell'insulina 12

3. Caratteristiche generali delle proprietà fisico-chimiche e farmaceutiche dell'insulina 15

4. Preparazioni di insulina 24

5. Metodi di produzione, standardizzazione e controllo di qualità delle preparazioni di insulina 31

6. L'uso di HPLC nell'analisi farmaceutica dell'insulina. 46

CAPITOLO 2. Dichiarazione di problema 50

CAPITOLO 3. Studio dell'influenza di vari fattori sul comportamento cromatografico dell'insulina nelle condizioni di RP HPLC 56

1. Metodi e materiali 57

2. Discussione dei risultati 62

2.1. L'influenza della composizione della soluzione tampone 62

2.2. L'effetto della concentrazione di sodio solfato 68

2.3. Effetto della temperatura della colonna cromatografica 70

2.4. Effetto del modificatore organico 75

2.5. L'influenza della lunghezza del radicale alchilico della fase innestata 80

2.6. L'influenza della lunghezza della colonna cromatografica 80

CAPITOLO 4. Miglioramento dei metodi farmacologici per l'analisi dei preparati insulinici basati sull'uso di RP HPLC 82

1. Selezione delle condizioni ottimali per la determinazione cromatografica dell'insulina e delle sue impurità nelle preparazioni medicinali 82

2. Caratteristiche metrologiche del metodo 84

3. Applicazione della metodologia sviluppata per testare i preparati ufficiali di insulina 95

CAPITOLO 5. Sviluppo di metodi per l'analisi di forme di dosaggio iniettabili di isofano-insulina basate sul metodo HPLC PF 107

1. La scelta delle condizioni per la determinazione cromatografica della protamina nelle forme di dosaggio di isofano-insulina 110

2. Studio dei profili cromatografici di protamine isolate da varie specie ittiche 121

3. Metodo per la determinazione della protamina nelle preparazioni di insulina isofano 123

4. Validazione della metodologia sviluppata 125

Conclusioni generali 136

Riferimenti 139

Caratteristiche generali delle proprietà fisico-chimiche e farmaceutiche dell'insulina

Da un punto di vista chimico, l'insulina è una piccola proteina globulare con un peso molecolare fino a 6000 Da. Allo stesso tempo, va notato che l'insulina è un nome comune per un'intera famiglia di proteine ​​omologhe di origine naturale e artificiale con un'attività biologica caratteristica comune. La natura proteica dell'insulina è stata stabilita nel 1928 [52]. È tra le proteine ​​che producono la reazione del biureto e la reazione di Pauli. La struttura dell'insulina è stata completamente stabilita nei primi anni '50. La composizione chimica elementare delle insuline di varia origine è caratterizzata dalle cifre riportate nella tabella 1 [40].

Composizione di aminoacidi La maggior parte delle molecole di insulina contiene 51 residui di amminoacidi, tra cui 17 aminoacidi trovati nelle proteine ​​più note.

Una caratteristica della composizione aminoacidica dell'insulina bovina, porcina e umana è il triptofano e la metionina. La composizione aminoacidica di questi tipi di insulina è presentata nella tabella 2 [40,46].

Invariabile a tutti i tipi di insulina è il contenuto di cistina (6 residui di mezzo cistina). Inoltre, la molecola di insulina di tutti i tipi contiene 6 gruppi ammidici (asparagina, glutammina).

Quando l'insulina viene rilasciata, insieme alla frazione principale, si possono osservare frazioni di forme deammidificate di insulina. Nell'ambiente acido, nel processo di deammidazione, tutti i 6 gruppi ammidici possono essere gradualmente separati e la mobilità elettroforetica e cromatografica dei cambiamenti dell'insulina [40]. La formazione di forme deammidificate di insulina può essere giudicata dai risultati della determinazione dell'ammoniaca. Per la forma completamente ammide di insulina, vengono determinati 6 moli di ammoniaca per 1 moli di proteina, per le forme deammidate questo valore può essere compreso tra 5 e 0.

La struttura primaria di insulina. La struttura primaria dell'insulina è stata decifrata dal gruppo Sanger nel 1945-1955. Utilizzando un numero di metodi cromatografici che hanno reso possibile la separazione e l'identificazione di vari peptidi, amminoacidi e loro derivati, Sanger è stato in grado di stabilire la struttura primaria dell'insulina bovina [130,131,132,133,134,135]. Ulteriori studi su insuline di varia origine utilizzando una varietà di metodi fisico-chimici, incluso il metodo Edman per determinare la sequenza completa di amminoacidi in peptidi lunghi, hanno confermato i risultati di Sanger e dei suoi coautori sulla struttura dell'insulina [bb].

Ad oggi, la struttura primaria dell'insulina è stata determinata in rappresentanti di 24 specie appartenenti a 4 classi di animali: mammiferi, uccelli, pesci e ciclostomi [14]. La ricerca su insulina di varia origine continua [71,72,73].

La struttura dell'insulina in diversi animali è simile, ma non identica. Nella sua struttura primaria, l'insulina umana è simile alle insuline di maiale, cane, capodoglio e coniglio, differendo solo in un amminoacido [40]. Si differenzia dall'insulina bovina da tre aminoacidi. In misura maggiore, l'insulina umana non è simile all'insulina del maiale, degli uccelli e dei pesci della Guinea [40]. Le differenze nella sequenza aminoacidica di insuline umane, suine e bovine sono mostrate nella Tabella 3.

Nonostante le differenze strutturali, tutti i tipi di insulina hanno un'attività biologica simile, vale a dire causa l'effetto ipoglicemico. Tuttavia, l'entità dell'attività biologica visualizzata dipende fortemente dalla specie e si trova nell'intervallo di 11 UI / mg (insulina di merluzzo dal Mare del Nord) a 62 UI / mg (insulina di tacchino e pollo), mentre l'attività dell'insulina umana è di circa 25-30 UI / mg [40]. Maggiore è la differenza interspecie, maggiore è la differenza nell'attività biologica dell'insulina corrispondente.

Una molecola di insulina funzionalmente attiva è costituita da due catene di polipeptidi (catene A e B) collegate da legami disolfuro; un legame è formato dal settimo residuo amminoacidico di entrambe le catene, il secondo legame disolfuro è formato dal 20 ° residuo della catena A e dal 19 ° residuo della catena B (Figura 2). Inoltre, vi è un terzo legame disolfuro nella molecola di insulina, che è l'intrachain e collega i residui della sesta catena A e della 6a catena [59,117].

Struttura secondaria Utilizzando vari metodi di ricerca fisico-chimica e fisica, è stato dimostrato che la molecola di insulina ha una struttura spaziale altamente ordinata (conformazione), che contribuisce all'implementazione di specifiche funzioni biologiche [14]. Nella molecola dell'insulina nativa, entrambi i fogli cc-helix e p-fold sono presenti simultaneamente. Inoltre, ci sono aree con struttura e struttura disordinata <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Quando una soluzione acida di insulina (pH 2,3-2,5) viene riscaldata a una temperatura di +100 ° C e rapidamente raffreddata a -80 ° C, si forma la cosiddetta insulina fibrillare - una forma completamente inattiva dell'ormone [27]. L'introduzione di fibre di insulina fibrillare in una soluzione di insulina attiva causa la precipitazione quantitativa spontanea di insulina sotto forma di fibrille [14,17].

Metodi di produzione, standardizzazione e controllo di qualità delle preparazioni di insulina

Ottenere specie di insulina animale. La produzione industriale di insulina di manzo e di maiale fu stabilita quasi contemporaneamente in un certo numero di paesi, subito dopo la scoperta di insulina nel 1921 [63]. Da allora, il concetto di ottenere insulina è rimasto praticamente invariato (tabella b) [17, 18]. Le materie prime per la produzione di specie animali di insulina sono il pancreas del bestiame da macello utilizzato per il cibo.

Il compito più importante nella produzione di insulina è la sua depurazione - il rilascio di sostanze dalle impurità correlate, che riducono l'attività biologica, causano reazioni immunologiche o sono potenzialmente pericolose per la salute del paziente. Ad esempio, dopo diversi anni di utilizzo dell'insulina non purificata nel sangue del paziente, possono esserci fino a 5.000 UI di insulina legata agli anticorpi. Gli anticorpi anti-insulina influenzano in modo significativo il profilo della sua azione e, quindi, contribuiscono al corso labile del diabete.

Il primo metodo di purificazione dell'insulina era la ricristallizzazione in presenza di sali di zinco. Nel 1945, è stato dimostrato che la ricristallizzazione settupla di insulina riduce significativamente il livello delle reazioni allergiche nei pazienti, rispetto ai preparati insulinici ufficiali in quel momento [63].

L'eterogeneità dei campioni di insulina dopo la cristallizzazione e la ricristallizzazione singola viene mostrata utilizzando una varietà di metodi: estrazione controcorrente (PE), cromatografia di distribuzione (PX), cromatografia a scambio ionico (IOC), diskelectrophoresis (DEP) e cromatografia a esclusione di gel (GEC) [63].

È stato riscontrato che le principali impurità concomitanti di insulina sono: proinsulina, suoi intermedi, dimero dell'insulina covalente, insulina mono-disamidale, monoarginina e monoetilene, nonché un numero di composti altamente molecolari di natura non insulinica. Una conclusione generalizzata dai risultati degli studi, tenendo conto delle informazioni sull'attività immunologica delle impurità rilevate [138], è stata la conclusione sulla necessità di una ulteriore purificazione delle sostanze insuliniche, in modo che durante l'analisi con metodi DEF e GEC, è stato trovato un componente - l'insulina corrispondente.

Per risolvere il problema della purificazione dell'insulina nel 1950, fu proposto il metodo HEC e, nel 1970, il metodo della cromatografia a scambio anionico (AOX). È stato riscontrato che l'insulina, purificata con il metodo AOX, contiene circa 500 ppm (parti per milione) di impurità con attività proinsulinica [137]. La purificazione aggiuntiva di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione su fasi invertite (RP HPLC) riduce il contenuto di frazioni immunogeniche al limite del loro rilevamento [63].

Una rassegna degli attuali sviluppi nel campo della purificazione cromatografica dell'insulina è presentata in [96]. L'insulina, purificata, sequenzialmente, usando IOC e GEC, è chiamata insulina monocomponente [63]. Ottenere l'insulina umana. La ricerca di metodi per ottenere l'insulina umana era dovuta a due circostanze. Da un lato, l'urgenza del problema delle materie prime nel caso della produzione di insulina animale, dall'altro, il rapido sviluppo della scienza in quest'area ha fornito una reale opportunità per dare vita all'idea. Nel 1979 e nel 1981 quasi contemporaneamente, sono stati sviluppati due metodi per ottenere l'insulina umana - biosintetici e semi-sintetici [102,108]. Nel 1981, la società Novo Nordisk per la prima volta nel mondo iniziò la produzione seriale di insulina semisintetica umana. Il metodo utilizzato dalla società si basa sulla sostituzione enzimatica e chimica di Al nella molecola di insulina suina con il resto di Tre [61]. Questo metodo dipende direttamente dall'ottenimento della quantità necessaria di insulina porcina, che riduce il suo valore economico. La possibilità di ottenere l'insulina umana mediante il metodo biosintetico è apparsa con lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante [10]. La produzione di insulina geneticamente modificata è iniziata circa 25 anni fa. Nel 1978, fu riportato che un ceppo di E. coli che produceva la procura di ratto era ottenuto. Nel 1979, gli studi di Genentech furono in grado di clonare in E. coli i geni che codificano per sequenze di amminoacidi. catene di insulina A e B incluse nella regione p-halo-tacidasi del plasmide pBR322 [10,102]. Nel 1981, un analogo del gene della proinsulina della mini-C-proinsulina fu sintetizzato, in cui il peptide C a 35 membri fu sostituito da un segmento di sei amminoacidi: arg-arg-gly-ser-lys-arg e fu mostrata la sua espressione in E. coli. Nel 1982, la società Eli Lilly ha iniziato la prima produzione industriale mondiale di insulina umana utilizzando due tecnologie a catena sviluppate in collaborazione con Genentech [102]. Attualmente, è stata dimostrata la possibilità di ottenere insulina umana con l'aiuto di vari sistemi di espressione [3,10,101,102]. Da un punto di vista economico, l'uso di ceppi geneticamente modificati di batteri E.coli gram-positivi, molti dei quali sono considerati sovraproduttori, è di particolare interesse [3]. Allo stesso tempo, sono stati ottenuti progressi significativi con le cellule di lievito Saccharomices cerevisiae [3.75]. La Tabella 7 elenca i principali, comuni ai vari metodi di produzione dell'insulina umana ricombinante, le fasi del processo tecnologico [3,10,63].

Applicazione della metodologia sviluppata per testare i preparati ufficiali di insulina

La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è una variante della cromatografia liquida di colonna in cui l'eluente fase mobile passa attraverso il sorbente che riempie la colonna ad alta velocità a causa di una pressione significativa (fino a 400x105 Pa) all'ingresso della colonna [11].

Come metodo per analizzare miscele complesse di sostanze, l'HPLC è comparsa poco più di 30 anni fa. L'uso di assorbenti con un diametro delle particelle di 3-10 μm ha causato un netto aumento dell'efficienza della separazione cromatografica rispetto alla versione classica della cromatografia liquida su colonna. Pertanto, l'HPLC viene spesso definita cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Le caratteristiche strumentali dell'uso dell'HPLC sono descritte in dettaglio in numerosi manuali [49.50] e nelle sezioni pertinenti della farmacopea principale [79, 150]. Per l'HPLC è stata sviluppata e prodotta una vasta gamma di sorbenti. Secondo gli autori del sondaggio [51] - circa 100 aziende in tutto il mondo producono più di 300 tipi di nomi di sorbenti. La storia, lo stato attuale e le prospettive per lo sviluppo del metodo sono discussi nelle recensioni [51] e [77.78].

Nelle sue varie varianti, il metodo HPLC è ampiamente utilizzato nell'analisi farmaceutica (controllo della produzione e test della qualità dei farmaci). Il metodo è incluso in tutte le principali farmacopee del mondo. Questo metodo è descritto in modo completo nelle Farmacopee europee e americane. L'HPLC viene utilizzato per identificare i farmaci, per determinare la purezza, la composizione frazionaria del peso molecolare e l'analisi quantitativa. Nella farmacopea degli Stati Uniti 28 ed. circa il 30% degli articoli privati ​​riguarda l'uso di HPLC. Nella Farmacopea Europea 4 ° ed. questa cifra è di circa il 40%.

Il primo metodo cromatografico per il test dell'insulina era la cromatografia liquida ad esclusione di gel a bassa pressione (GE ZhND). Il principio di separazione nelle condizioni dell'HPLC si basa sulla diversa capacità delle molecole di diverse dimensioni di penetrare nei pori del gel neutro, che funge da fase stazionaria. Il diametro idrodinamico del monomero di insulina e dimero è proporzionale al loro peso molecolare ed è 2,69 e 5,50 nm, rispettivamente [115].

Nel 1967, utilizzando il metodo GE-IHDD, è stato dimostrato che le preparazioni commerciali di insulina, purificate per cristallizzazione, contengono impurezze con un peso molecolare che supera il peso molecolare dell'insulina [63]. Sui cromatogrammi dell'insulina suina sono stati trovati tre picchi, convenzionalmente designati come componenti a-, b- e c. Da allora, un certo numero di sistemi cromatografici sono stati proposti per controllare il contenuto di impurezze ad alto peso molecolare in preparazioni di insulina. La separazione è stata effettuata su xerogel di agarosio altamente rigonfianti (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) O destrano (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), sono state utilizzate soluzioni da 1-3 M di acido acetico come IF [127]. L'alta sensibilità di questi assorbenti alla compressione a pressioni che superano la pressione di rigonfiamento della matrice rende questi materiali inadatti per il funzionamento in modalità HPLC.

L'uso della cromatografia liquida ad esclusione di gel ad alte pressioni (GE HPLC) per l'analisi dell'insulina è stato descritto per la prima volta nel 1980, dopo lo sviluppo di sorbenti macroporosi rigidi compatibili con l'acqua e resistenti alle alte pressioni. In [151], la separazione è stata effettuata su colonne Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) in condizioni denaturanti (combinazione di soluzione 7 M di urea, acidi minerali e non ionici detergenti). La necessità di analisi dell'insulina in condizioni denaturanti è associata alla capacità dell'insulina di aggregarsi in soluzione. Per la separazione di insulina nelle condizioni dell'HPLC HPLC, è stato anche descritto l'uso dell'acido acetico "tradizionale" eluente [152]. L'uso dell'acido acetico ha diversi vantaggi: l'impatto minimo sulla struttura nativa dei composti separati, la disponibilità, il basso costo, inoltre, un fatto importante è la capacità dell'acido acetico di sopprimere l'associazione dell'insulina.

Attualmente, GE HPLC è un metodo farmacopea per monitorare il contenuto di impurità ad alto peso molecolare in sostanze e forme di dosaggio finito. Il metodo viene anche utilizzato per determinare il contenuto di protamina nelle preparazioni di insulina isofano.

L'uso dell'HPLC su fasi inverse (RP HPLC) per la separazione dell'insulina bovina e suina per la prima volta ha dimostrato l'elevata efficacia di questo metodo per l'analisi di peptidi insulino-simili con una struttura simile.

Il meccanismo di separazione delle proteine ​​e dei polipeptidi nelle condizioni di RP HPLC si basa sulla diversa idrofobicità delle molecole di insulina e delle relative impurità. Ad oggi, sono state descritte diverse dozzine di metodi per la separazione cromatografica di insulina di varia origine e dei loro derivati, tra cui proinsolfato, polipeptidi pancreatici, derivati ​​del dezamido, dimero dell'insulina. [126] ha mostrato la possibilità di separare l'insulina di pollo, coniglio, pecora e cavallo. Sono stati inoltre separati l'insulina umana, di manzo e di maiale. Lloyd e Corran pubblicarono un metodo per separare manzo, maiale, insuline umane e le loro corrispondenti forme deammidate [104].

La separazione viene eseguita su gruppi di sorbenti di gel di silice modificati, metilici, butilici, ottilici, ottadecilici e fenilici in modalità isocratica o gradiente. Come PF, vengono utilizzati modificatori organici - acetonitrile, alcol metilico, alcol isopropilico, miscelati con soluzioni tampone acquose contenenti sali inorganici e reagenti a vapore di ioni. Il rilevamento del picco viene effettuato principalmente mediante il metodo spettrofotometrico ad una lunghezza d'onda di 190-220 nm, sono descritti anche i metodi fluorimetrici [103].

L'analisi della sostanza e le forme di dosaggio finite di insulina utilizzando l'HPLC RP sono descritte in articoli privati ​​nella farmacopea americana ed europea [79,150]. Il metodo viene utilizzato per testare i farmaci del gruppo specificato in termini di "Autenticità dell'insulina", "Proteine ​​correlate", "Determinazione quantitativa" e "Insulina in soluzione".

La letteratura di ricerca descrive anche l'uso della cromatografia a scambio ionico e di affinità per l'analisi dell'insulina [44,102], tuttavia questi metodi non sono stati ampiamente utilizzati nella pratica farmacopea.

La scelta delle condizioni per la determinazione cromatografica della protamina nelle forme di dosaggio di isofano-insulina

Un aumento della resistenza ionica PF porta solitamente ad un aumento dei rapporti di capacità insulinica, che può essere causato da una serie di fattori: - l'aumento della concentrazione di ioni riduce il grado di ionizzazione dei gruppi carichi della molecola proteica, aumentando la sua idrofobicità / - alta concentrazione di cationi contribuisce a gruppi silanol liberi sulla superficie una fase che indebolisce l'interazione elettrostatica non specifica dei gruppi amminici protonati della proteina con la matrice; - l'alta forza ionica influisce sulla struttura spaziale dell'insulina, in conseguenza della quale la superficie disponibile all'interazione con il sorbente cambia. La concentrazione di sali inorganici nella VFS influenza la forma dei picchi e la selettività della separazione di insulina e desamido-Asn-insulina [143,144]. Con eluizione isocratica su LiChrosorb Сів sorbente con una soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (pH 2,3), è stato ottenuto un risultato soddisfacente solo quando il solfato di sodio è stato aggiunto alla soluzione tampone ad una concentrazione di 0,1 M. La maggior parte dei metodi di analisi dell'insulina inclusi negli articoli farmacopea e ND, utilizzare PF sulla base di soluzioni tampone con un contenuto di solfato di sodio pari a 0,2 M. Un contenuto così elevato di solfato di sodio influenza negativamente la riproducibilità dei risultati cromatografici a causa della stratificazione degli eluenti, inoltre, soluzioni saline altamente concentrate hanno un effetto negativo sulle apparecchiature cromatografiche, riducendone la durata. Considerando che i metodi di analisi farmacologica sono stati sviluppati più di 20 anni fa, è sembrato interessante studiare il comportamento cromatografico dell'insulina sotto OF-HPLC sui sorbenti cromatografici di ultima generazione, a seconda della concentrazione di solfato di sodio. Allo stesso tempo, hanno cercato di scoprire se una riduzione del contenuto di solfato di sodio in PF è ammissibile senza un significativo deterioramento della capacità di separazione del sistema cromatografico. Come risultato della ricerca è emerso che l'effetto della concentrazione di solfato di sodio nel PF è diverso, a seconda del tipo di fase innestata, nonché della specie di insulina. Sui sorbenti con gruppi innestati C4 e C la selettività della separazione dei picchi di insulina umana e desamido-Asn-insulina umana non dipende dalla concentrazione di solfato di sodio in. soluzione tampone1 nell'intervallo da 0,05 M a 0,2 M. Sul sorbente Diaspher-110-C18, la selettività di separazione di questa coppia di picchi ha un massimo a 0,05 M e un minimo a 0,1 M (grafico 4). D'altra parte, la selettività della separazione delle specie animali di insulina e le loro corrispondenti forme AsnA21 desamidate non dipende dalla forza ionica della soluzione quando è separata su un assorbente Diaspher-110-C18. Su un sorbente con gruppi innestati con C8, la selettività aumenta da 1,25 a 1,28 con un aumento della concentrazione di solfato di sodio (figura 4). Su un sorbente con gruppi C4 innestati, la selettività della separazione nel caso dell'insulina di manzo è massima a 0,1 M di solfato di sodio e minimo a 0,2 M. Per l'insulina di maiale, non c'è un massimo pronunciato a una concentrazione di solfato di sodio di 0,1 M, in questo caso un aumento di ioni le forze hanno portato ad una diminuzione della selettività della separazione (figura 4). Il numero di piastre teoriche efficaci aumenta con l'aumentare della concentrazione di solfato di sodio. L'eccezione è il comportamento dell'insulina umana sul sorbente Diasfer-110-C8 (figura 5). Il grado di separazione dei picchi di insulina e desamido-Asn-insulina aumenta con un aumento della forza ionica delle FS, indipendentemente dalla specie di insulina e dal tipo di fase dell'innesto (diagramma b). Riducendo la concentrazione di solfato di sodio da 0,2 M a 0,1 M, il grado di separazione della coppia selezionata di picchi diminuisce in media del 5% per le insuline umane e suine e del 10% per l'insulina di manzo. Tenendo conto del fatto che il valore assoluto del grado di separazione supera 2.0, il deterioramento misurato nella capacità di separazione della colonna, a nostro avviso, non è significativo. Di conseguenza, la concentrazione di solfato di sodio nella soluzione tampone PF può essere ridotta di 2 volte rispetto ai metodi di analisi farmacopea.

Nella maggior parte degli studi sull'analisi di proteine ​​e peptidi, la separazione viene effettuata a temperatura ambiente. Inoltre, alcuni autori indicano che l'effetto della temperatura sulla selettività della separazione è minimo [48]. Tuttavia, con l'aumentare della temperatura, il processo di scambio di massa tra le fasi stazionarie e mobili viene accelerato, il che porta ad una diminuzione del tempo di ritenzione dei peptidi e al restringimento dei picchi.

L'insulina è standardizzata da

Il pancreas è uno degli organi più importanti con doppia secrezione - interna ed esterna.
Il prodotto della secrezione interna è l'insulina, che svolge un ruolo importante nel metabolismo dei carboidrati. L'insulina è un prodotto di un tipo speciale di cellule raggruppate nelle cosiddette "isole" di Langerhans.

Segreto esterno è il succo pancreatico contenente tripsina - uno dei più importanti enzimi digestivi, che è secreto dalle ghiandole che costituiscono la massa principale del pancreas. La tripsina è la parte principale della preparazione della pancreatina.
Insulina (insulina). L'insulina è stata isolata nella sua forma pura nel 1921. Esistono molti metodi per la sua fabbricazione, differiscono tra loro per lo più solo nei dettagli.

A causa del fatto che, oltre all'insulina, l'enzima tripsina è contenuto nel pancreas, che rompe l'insulina abbastanza facilmente, i primi tentativi di ottenere l'insulina dal pancreas fallito. Pertanto, abbiamo cercato di ottenerlo da una ghiandola in cui questo enzima sarebbe assente, ad esempio, dalle ghiandole del pesce o dai vitelli intrauterini. Ma anche questi tentativi di successo produttivo non hanno avuto, dal momento che nei pesci la dimensione della ghiandola è molto piccola e l'escrezione della ghiandola stessa è tecnicamente difficile da attuare; l'estrazione delle ghiandole dai vitelli intrauterini in grandi quantità per la produzione presenta notevoli difficoltà.
Finalmente, nel 1922, gli esperimenti con la ghiandola dei bovini maturi mostrarono che quando si usa l'alcol forte acidificato, gli enzimi (tripsina, ecc.) Sono inattivati ​​e perdono la capacità di distruggere l'insulina.

Schema tecnologico di produzione. Per la produzione di insulina viene utilizzato il pancreas congelato o fresco principalmente da bovini e suini.
Triturazione. Al fine di evitare la distruzione dell'ormone con tripsina, le ghiandole fresche non oltre 30 minuti dopo la macellazione dell'animale devono essere pulite dai tessuti adiacenti, schiacciate in un tritacarne.

Estrazione. Le ghiandole frantumate sono versate con alcool al 95%, acidificate con acido solforico (1 parte della ghiandola è 1,5 parti di alcol 95 ° senza aldeidi + 0,5% di acido solforico o cloridrico). La miscela viene estratta con il raffreddamento per 1,5 ore, mescolando continuamente.
Il primo estratto viene drenato, il residuo viene strizzato o centrifugato. L'estrazione viene nuovamente estratta con 1 ora di alcool a 60 ° (e non a 95 °, poiché non c'è umidità nella materia prima) - una parte della ghiandola prende una parte dell'alcol. Entrambi gli estratti vengono drenati insieme e filtrati attraverso un foglio.

Rimozione delle proteine ​​di zavorra. Dall'estratto ottenuto, le proteine ​​vengono rimosse in vari modi:
1) stabilendosi a freddo (da -4 a 0 ° С) entro 48 h.
2) aggiungere la soluzione di idrossido di sodio all'estratto a pH 6,6 - 6,8 (in alcuni casi - a pH = 6,4 - 6,6).

La precipitazione viene separata mediante centrifuga, filtrazione o sedimentazione.
Evaporazione e sgrassaggio. Il liquido chiaro risultante viene acidificato con acido solforico puro a pH = 2,5 ed è sottoposto ad evaporazione a 1/10 del volume ad una temperatura non superiore a 40 ° C.
Dopo aver rimosso tutto l'alcool, il liquido è sgrassato.

Salatura e pulizia. Il solfato di ammonio viene aggiunto al filtrato sgrassato alla saturazione, dopo di che emerge insulina con una piccola quantità di sostanze di zavorra, formando una crosta di insulina grezza, che viene rimossa ed essiccata e quindi sgrassata con una miscela di etere etilico.
L'insulina sgrassata viene essiccata in condizioni ambientali e macinata in polvere. Le polveri di efflorescenza sono sottoposte a ulteriore purificazione per ottenere insulina cristallina contenente almeno 22 U in 1 mg.
Standardizzazione. L'insulina risultante è una polvere bianca o leggermente grigiastro. È solubile in acqua e in una soluzione acquosa di alcool fino a 80 °, ma insolubile in alcool con una fortezza sopra 90 °. Quando l'insulina viene disciolta in acqua, si ottiene un liquido incolore o leggermente giallastro.

Per la conservazione, 0,3% di tricresolo o fenolo viene aggiunto alla soluzione e sottoposto a standardizzazione biologica. Quando l'insulina viene iniettata nei conigli, il loro contenuto di carboidrati nel sangue da 1,5-5 ore dovrebbe diminuire in media del 50%, cioè dallo 0,09 allo 0,045% (vedere Farmacopea, 9a edizione). La dose corrispondente è chiamata un'unità di coniglio, che è uguale a tre umani o tre clinici.
Packaging. La soluzione è passata attraverso un filtro batterico. Quindi il filtrato viene versato in una soluzione asettica in flaconi da 5 o 10 ml in ciascun millilitro di soluzione di insulina che deve contenere 40 o 80 U.

Le fiale sono chiuse con tappi di gomma arrotolati con tappi di alluminio.
Le etichette sono apposte sulle bottiglie e sulla scatola con le bottiglie, su cui devono essere indicate l'attività di preparazione, la data di produzione, la durata di conservazione, ecc.

Prima di usare l'insulina, il tappo di alluminio viene aperto, pulito con alcool, poi un tappo viene perforato con un ago sterile e la quantità necessaria di liquido viene aspirata nella siringa, che viene iniettata per via sottocutanea o intramuscolare.
Bagagli. L'insulina è immagazzinata in flaconcini. La durata di conservazione è di 18 mesi a una temperatura non superiore a 10 ° C, poiché a temperature più elevate, l'insulina può parzialmente perdere attività.

Segni esterni di inadeguatezza: annebbiamento della soluzione o precipitazione, comparsa di muffa all'interno delle fiale o colonie di microrganismi.

Gruppo farmacologico - Insuline

I preparativi per sottogruppi sono esclusi. permettere

descrizione

L'insulina (dal latino Insula-isolotto) è un ormone peptidico-proteico prodotto dalle cellule beta delle isole pancreatiche di Langerhans. In condizioni fisiologiche, l'insulina β-cellule è formata dalla preproinsulina, una proteina precursore a catena singola costituita da 110 residui di aminoacidi. Dopo che il reticolo endoplasmatico ruvido viene trasferito attraverso la membrana, un peptide segnale 24 amminoacidi viene scisso dalla preproinsulina e la proinsulina è formata. La lunga catena di proinsulina nell'apparato di Golgi è confezionata in granuli, dove a seguito dell'idrolisi quattro residui di amminoacidi principali vengono scissi per formare insulina e il peptide C-terminale (la funzione fisiologica del peptide C è sconosciuta).

La molecola di insulina è costituita da due catene di polipeptidi. Uno di questi contiene 21 residui di amminoacidi (catena A), il secondo - 30 residui di amminoacidi (catena B). Le catene sono collegate da due ponti disolfuro. Il terzo ponte disolfuro è formato all'interno della catena A. Il peso molecolare totale della molecola di insulina è di circa 5700. La sequenza di amminoacidi dell'insulina è considerata conservativa. La maggior parte delle specie ha un gene insulinico che codifica per una proteina. L'eccezione sono ratti e topi (hanno due geni dell'insulina), producono due insulina, che differiscono in due residui amminoacidici della catena B.

La struttura primaria di insulina in varie specie biologiche, incl. e in diversi mammiferi, in qualche modo diversi. Il più vicino alla struttura dell'insulina umana è l'insulina suina, che differisce da quella umana per un amminoacido (ha un residuo di alanina nella catena B invece del residuo di amminoacido treonina). L'insulina bovina differisce dai residui umani di tre amminoacidi.

Sfondo storico Nel 1921, Frederick G. Banting e Charles G. Best, lavorando nel laboratorio di John J. McLeod all'Università di Toronto, estrassero un estratto dal pancreas (come in seguito si rivelò contenere l'insulina amorfa), che ridusse il livello di glucosio nel sangue nei cani con diabete sperimentale. Nel 1922, un estratto del pancreas fu iniettato nel primo paziente, il quattordicenne Leonard Thompson, che ha il diabete, e così gli salvò la vita. Nel 1923, James B. Collip sviluppò un metodo per la purificazione di un estratto estratto dal pancreas, che in seguito consentì la preparazione di estratti attivi dalle ghiandole pancreatiche di suini e bovini, che danno risultati riproducibili. Nel 1923, Banting e McLeod ottennero il premio Nobel in Fisiologia e Medicina per la scoperta dell'insulina. Nel 1926, J. Abel e V. Du-Vigno ottennero insulina in forma cristallina. Nel 1939, l'insulina fu prima approvata dalla FDA (Food and Drug Administration). Frederick Sanger decifrò completamente la sequenza aminoacidica dell'insulina (1949-1954) Nel 1958, Sanger ottenne il premio Nobel per il suo lavoro sulla decifrazione della struttura delle proteine, in particolare dell'insulina. Nel 1963, l'insulina artificiale fu sintetizzata. La prima insulina umana ricombinante è stata approvata dalla FDA nel 1982. Un analogo di insulina ad azione ultracorta (insulina lispro) è stato approvato dalla FDA nel 1996.

Il meccanismo di azione. Nell'attuare gli effetti dell'insulina, il ruolo principale è giocato dalla sua interazione con specifici recettori localizzati sulla membrana plasmatica della cellula e dalla formazione del complesso del recettore dell'insulina. In combinazione con il recettore dell'insulina, l'insulina entra nella cellula, dove influenza la fosforilazione delle proteine ​​cellulari e innesca numerose reazioni intracellulari.

Nei mammiferi, i recettori dell'insulina si trovano su quasi tutte le cellule, sia su cellule classiche bersaglio di insulina (epatociti, miociti, lipociti), sia su cellule del sangue, cervello e ghiandole sessuali. Il numero di recettori su diverse cellule varia da 40 (eritrociti) a 300 mila (epatociti e lipociti). Il recettore dell'insulina è costantemente sintetizzato e decomposto, la sua emivita è di 7-12 ore.

Il recettore dell'insulina è una grande glicoproteina transmembrana costituita da due subunità α con una massa molecolare di 135 kDa (ciascuna contiene 719 o 731 residui di amminoacidi a seconda dello splicing di mRNA) e due subunità β con una massa molecolare di 95 kDa (620 residui di amminoacidi). Le subunità sono interconnesse da legami disolfuro e formano una struttura eterotetramerica β-a-α-β. Le subunità alfa si trovano extracellulari e contengono siti che legano l'insulina, essendo la parte di riconoscimento del recettore. Le subunità beta formano un dominio transmembrana, possiedono attività di tirosina chinasi e svolgono la funzione di conversione del segnale. Il legame dell'insulina alla subunità α del recettore dell'insulina porta alla stimolazione dell'attività tirosin-chinasi delle subunità β autofosforilanti i loro residui di tirosina, l'aggregazione di α, β-eterodimeri e la rapida internalizzazione dei complessi recettore ormonale. Il recettore dell'insulina attivato inizia una cascata di reazioni biochimiche, incl. fosforilazione di altre proteine ​​all'interno della cellula. La prima di queste reazioni è la fosforilazione di quattro proteine, chiamate substrati del recettore dell'insulina (substrato del recettore dell'insulina), IRS-1, IRS-2, IRS-3 e IRS-4.

Effetti farmacologici di insulina L'insulina colpisce praticamente tutti gli organi e i tessuti. Tuttavia, i suoi bersagli principali sono il fegato, i muscoli e il tessuto adiposo.

L'insulina endogena è il regolatore più importante del metabolismo dei carboidrati, l'insulina esogena è uno specifico agente riducente dello zucchero. L'effetto dell'insulina sul metabolismo dei carboidrati è dovuto al fatto che aumenta il trasporto del glucosio attraverso la membrana cellulare e il suo utilizzo da parte dei tessuti, contribuisce alla conversione del glucosio in glicogeno nel fegato. L'insulina, inoltre, inibisce la produzione endogena di glucosio sopprimendo la glicogenolisi (la scomposizione del glicogeno in glucosio) e la gluconeogenesi (la sintesi del glucosio da fonti non di carboidrati - ad esempio, da aminoacidi, acidi grassi). Oltre all'ipoglicemia, l'insulina ha una serie di altri effetti.

L'effetto dell'insulina sul metabolismo dei grassi si manifesta nell'inibizione della lipolisi, che porta a una diminuzione del flusso di acidi grassi liberi nel sangue. L'insulina impedisce la formazione di corpi chetonici nel corpo. L'insulina migliora la sintesi degli acidi grassi e la loro successiva esterificazione.

L'insulina è coinvolta nel metabolismo delle proteine: aumenta il trasporto di aminoacidi attraverso la membrana cellulare, stimola la sintesi dei peptidi, riduce il consumo di proteine ​​da parte dei tessuti e inibisce la conversione degli aminoacidi in chetoacidi.

L'azione dell'insulina è accompagnata dall'attivazione o inibizione di un certo numero di enzimi: la glicogeno sintetasi, la piruvato deidrogenasi, l'esochinasi vengono stimolate, le lipasi (e idrolizzando i lipidi del tessuto adiposo e la lipoproteina lipasi, che riducono la torbidità sierica dopo l'ingestione di cibi ricchi di grassi).

Nella regolazione fisiologica della biosintesi e della secrezione di insulina da parte del pancreas, la concentrazione di glucosio nel sangue gioca un ruolo importante: con un aumento del suo contenuto, la secrezione di insulina aumenta e con una diminuzione rallenta. La secrezione di insulina, oltre al glucosio, è influenzata da elettroliti (soprattutto ioni Ca 2+), amminoacidi (tra cui leucina e arginina), glucagone, somatostatina.

Farmacocinetica. I preparati a base di insulina vengono iniettati s / c, per via intramuscolare o endovenosa (in / in, solo le insuline a breve durata d'azione vengono somministrate e solo in precoma e coma diabetici). È impossibile entrare in / in sospensioni di insulina. La temperatura dell'insulina dovrebbe essere a temperatura ambiente, dal momento che l'insulina fredda viene assorbita più lentamente. Il modo più ottimale per la terapia insulinica continua nella pratica clinica è sc. Introduzione.

La completezza dell'assorbimento e l'insorgenza dell'effetto insulinico dipendono dal sito di iniezione (solitamente l'insulina viene iniettata nell'addome, nelle cosce, nei glutei, nelle braccia), nella dose (volume di insulina iniettata), nella concentrazione di insulina nella preparazione, ecc.

Il tasso di assorbimento di insulina nel sangue dal sito di iniezione dipende da una serie di fattori, quali insulina, sito di iniezione, flusso sanguigno locale, attività muscolare locale, quantità di insulina iniettata (non si consiglia di iniettare più di 12-16 U del farmaco in un unico posto). Più rapidamente, l'insulina entra nel sangue dal tessuto sottocutaneo della parete addominale anteriore, più lentamente dalla spalla, dalla superficie anteriore della coscia e ancora più lentamente dal sottoscapolare e dai glutei. Ciò è dovuto al grado di vascolarizzazione del tessuto adiposo sottocutaneo delle aree elencate. Il profilo di azione dell'insulina è soggetto a fluttuazioni significative sia nelle diverse persone che nella stessa persona.

Nel sangue, l'insulina si lega alle alfa e beta globuline, normalmente 5-25%, ma il legame può aumentare durante il trattamento a causa della comparsa di anticorpi sierici (la produzione di anticorpi all'insulina esogena porta all'insulino-resistenza, con l'uso di moderni preparati altamente purificati, l'insulino-resistenza si verifica raramente ). T_1/2 di sangue è inferiore a 10 minuti. La maggior parte dell'insulina rilasciata nel flusso sanguigno subisce una degradazione proteolitica nel fegato e nei reni. Viene rapidamente espulso dai reni (60%) e dal fegato (40%); meno dell'1,5% viene escreto nell'urina invariata.

I preparati di insulina attualmente utilizzati differiscono in diversi modi, tra cui per fonte di origine, durata d'azione, pH della soluzione (acido e neutro), presenza di conservanti (fenolo, cresolo, fenolo-cresolo, metilparaben), concentrazione di insulina - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Classificazione. Le insuline sono generalmente classificate per origine (bovina, suina, umana, nonché analoghi dell'insulina umana) e durata dell'azione.

A seconda delle fonti di produzione, si distinguono insuline di origine animale (principalmente preparazioni di insulina di maiale), preparazioni di insulina umana semisintetica (ottenute dall'insulina di maiale mediante trasformazione enzimatica), preparati di insulina umana (DNA ricombinante, prodotto dall'ingegneria genetica).

Per uso medico, l'insulina è stata precedentemente ottenuta principalmente dal pancreas del bestiame, quindi dalle ghiandole pancreatiche dei suini, dato che l'insulina suina è più vicina all'insulina umana. Poiché l'insulina bovina, che differisce dai tre amminoacidi umani, causa spesso reazioni allergiche, oggi non viene praticamente utilizzata. Insulina suina, che differisce da quella dell'aminoacido umano, meno probabilità di causare reazioni allergiche. Nelle preparazioni di insulina medicinali, se la purificazione è insufficiente, possono essere presenti impurità (proinsulina, glucagone, somatostatina, proteine, polipeptidi) che possono causare varie reazioni collaterali. Le moderne tecnologie rendono possibile ottenere purificati (mono-picco-cromatograficamente purificati con il rilascio di insulina "picco"), altamente purificati (mono-componente) e preparati di insulina cristallizzata. Tra i preparati di insulina di origine animale, viene data preferenza all'insulina mono picco derivata dal pancreas dei suini. L'insulina ottenuta dall'ingegneria genetica è pienamente coerente con la composizione aminoacidica dell'insulina umana.

L'attività dell'insulina è determinata da un metodo biologico (in base alla sua capacità di ridurre la glicemia nei conigli) o da un metodo fisico-chimico (mediante elettroforesi su carta o cromatografia su carta). Per un'unità di azione o un'unità internazionale, prendi un'attività di 0,04082 mg di insulina cristallina. Il pancreas umano contiene fino a 8 mg di insulina (circa 200 U).

I preparati a base di insulina sono suddivisi in farmaci corti e ultracorti - imitano la normale secrezione fisiologica di insulina da parte del pancreas in risposta a stimolazione, farmaci di durata media e farmaci a lunga durata - imitano la secrezione insulinica basale (di fondo) e farmaci combinati (combinare entrambe le azioni).

Ci sono i seguenti gruppi:

Insuline ad azione ultracorta (l'effetto ipoglicemico si sviluppa 10-20 minuti dopo l'iniezione di s / c, il picco di azione viene raggiunto in media dopo 1-3 ore, la durata dell'azione è di 3-5 ore):

- insulina lispro (Humalog);

- insulina aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- insulina glulisina (apidra).

Insuline a breve durata d'azione (insorgenza dell'azione di solito dopo 30-60 minuti, massimo di azione dopo 2-4 ore, durata dell'azione fino a 6-8 ore):

- insulina solubile [ingegneria genetica umana] (Actrapid HM, Gensulin R, Rinsulin R, Humulin Regular);

- insulina solubile [semisintetico umano] (Biogulin R, Humodar R);

- Insulina solubile [monocomponente suina] (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Preparati di insulina a lunga durata d'azione - includono farmaci di durata media d'azione e farmaci a lunga durata d'azione.

Insuline di media durata d'azione (esordio dopo 1,5-2 ore, picco dopo 3-12 ore, durata 8-12 ore):

- Insulina isofano [ingegneria genetica umana] (Biosulina N, Gansulin N, Gensulin N, Insuman Bazal GT, Insuran NPH, Protafan NM, Rinsulin NPH, Humulin NPH);

- insulina isofano [semisintetico umano] (Biogulin N, Humodar B);

- insulina isofano [monocomponente suina] (Monodar B, Protafan MS);

- sospensione di composti zinco-insulina (Monotard MS).

Insuline ad azione prolungata (insorgenza dopo 4-8 ore, picco dopo 8-18 ore, durata totale 20-30 ore):

- insulina glargine (Lantus);

- insulina detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Preparazioni combinate di insulina (preparati bifasici) (l'effetto ipoglicemico inizia 30 minuti dopo la somministrazione di s / c, raggiunge un massimo dopo 2-8 ore e dura fino a 18-20 ore):

- insulina bifasica [semi-sintetica umana] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- insulina bifasica [umana geneticamente modificata] (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- insulina aspart bifasica (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Le insuline ad azione ultracorta sono analoghi dell'insulina umana. È noto che l'insulina endogena nelle cellule beta del pancreas, così come le molecole ormonali nelle soluzioni prodotte dall'insulina a breve durata d'azione, sono polimerizzate e sono esameri. Quando le forme esamiche di somministrazione di s / c vengono assorbite lentamente e la concentrazione massima dell'ormone nel sangue, simile a quella di una persona sana dopo aver mangiato, è impossibile da creare. Il primo analogo dell'insulina a breve durata d'azione, che viene assorbito dal tessuto sottocutaneo 3 volte più velocemente dell'insulina umana, era l'insulina lispro. L'insulina lispro è un derivato dell'insulina umana ottenuto scambiando due residui di amminoacidi nella molecola di insulina (lisina e prolina nelle posizioni 28 e 29 della catena B). La modifica della molecola dell'insulina interrompe la formazione di esameri e fornisce un rapido flusso del farmaco nel sangue. Quasi immediatamente dopo l'iniezione di s / c nei tessuti, le molecole di insulina lispro sotto forma di esameri si dissociano rapidamente in monomeri e penetrano nel sangue. Un altro analogo dell'insulina - insulina aspart - è stato creato sostituendo la prolina nella posizione B28 con acido aspartico caricato negativamente. Come l'insulina lispro, dopo l'iniezione sc, si scompone rapidamente anche nei monomeri. Nell'insulina glulisina, la sostituzione dell'insulina aminoacidica asparagina umana nella posizione B3 per lisina e lisina nella posizione B29 per l'acido glutammico contribuisce anche ad un assorbimento più rapido. Gli analoghi dell'insulina ad azione ultracorta possono essere somministrati immediatamente prima di un pasto o dopo un pasto.

Le insuline a breve durata d'azione (anche chiamate solubili) sono soluzioni in un tampone con valori di pH neutri (6,6-8,0). Sono destinati alla somministrazione sottocutanea, meno frequente - intramuscolare. Se necessario, vengono anche somministrati per via endovenosa. Hanno un effetto ipoglicemico rapido e relativamente breve. L'effetto dopo l'iniezione sottocutanea si verifica dopo 15-20 minuti, raggiunge un massimo dopo 2 ore; la durata totale dell'azione è di circa 6 ore e viene utilizzata principalmente in ospedale durante la determinazione della dose di insulina necessaria per il paziente, e anche quando è richiesto un effetto rapido (urgente) - in coma e precoma diabetici. Con il / nell'introduzione di T_1/2 fa 5 min. perciò a un comete ketoacidotic diabetico l'insulina è amministrata in / in una flebo. I preparati insulinici a breve durata d'azione sono anche usati come agenti anabolizzanti e sono prescritti, di regola, in piccole dosi (4-8 UI 1-2 volte al giorno).

Le insuline di media durata d'azione sono meno solubili, vengono assorbite più lentamente dal tessuto sottocutaneo e, di conseguenza, hanno un effetto più lungo. L'azione prolungata di questi farmaci è ottenuta dalla presenza di un prolungatore speciale - protamina (isofano, protaphan, basale) o zinco. Il rallentamento dell'assorbimento di insulina nei preparati contenenti sospensione di composto di zinco insulina, dovuta alla presenza di cristalli di zinco. L'insulina NPH (protamina neutra Hagedorn o isofano) è una sospensione costituita da insulina e protamina (la protamina è una proteina isolata dal latte di pesce) in un rapporto stechiometrico.

Le insuline a lunga durata d'azione includono l'insulina glargine - un analogo dell'insulina umana, ottenuta con la tecnologia del DNA ricombinante - il primo farmaco insulinico che non ha un picco di azione pronunciato. L'insulina glargine è ottenuta mediante due modifiche nella molecola di insulina: sostituzione della catena A (asparagina) con glicina in posizione 21 e collegamento di due residui di arginina al C-terminale della catena B. Il farmaco è una soluzione limpida con un pH di 4. Il pH acido stabilizza gli esameri di insulina e fornisce un assorbimento lungo e prevedibile del farmaco dal tessuto sottocutaneo. Tuttavia, a causa del pH acido, l'insulina glargine non può essere combinata con insuline a breve durata d'azione con pH neutro. Una singola iniezione di insulina glargine fornisce un controllo glicemico non picco 24 ore. La maggior parte delle preparazioni di insulina hanno un cosiddetto. "Picco" d'azione, notato quando la concentrazione di insulina nel sangue raggiunge il massimo. L'insulina glargine non ha un picco pronunciato, poiché viene rilasciata nel flusso sanguigno ad un ritmo relativamente costante.

Preparati a base di insulina di azione prolungata sono disponibili in varie forme di dosaggio che hanno un effetto ipoglicemico di diversa durata (da 10 a 36 ore). L'effetto prolungato riduce il numero di iniezioni giornaliere. Di solito vengono prodotti sotto forma di sospensioni, somministrati solo per via sottocutanea o intramuscolare. Negli stati di coma diabetico e pre-comatosi non vengono usati farmaci prolungati.

I preparati combinati di insulina sono sospensioni composte da insulina neutra solubile a breve durata d'azione e insulina isofano (durata media dell'azione) in alcuni rapporti. Questa combinazione di insuline di diversa durata d'azione in un'unica preparazione consente al paziente di risparmiare su due iniezioni con l'uso separato di farmaci.

Indicazioni. L'indicazione principale per l'uso di insulina è il diabete mellito di tipo 1, ma in determinate condizioni è anche prescritto per il diabete mellito di tipo 2, incl. con resistenza agli agenti ipoglicemici orali, con gravi malattie concomitanti, in preparazione a interventi chirurgici, coma diabetico, diabete in donne in gravidanza. Le insuline ad azione rapida sono utilizzate non solo nel diabete mellito, ma anche in altri processi patologici, ad esempio in esaurimento generale (come agente anabolico), foruncolosi, tireotossicosi, nelle malattie dello stomaco (atonia, gastroptosi), epatite cronica e forme primarie di cirrosi epatica così come in alcune malattie mentali (la somministrazione di grandi dosi di insulina - il cosiddetto coma ipoglicemico); a volte viene utilizzato come componente di soluzioni "polarizzanti" utilizzate per il trattamento dell'insufficienza cardiaca acuta.

L'insulina è il trattamento specifico principale per il diabete mellito. Il trattamento del diabete mellito viene effettuato secondo schemi appositamente sviluppati utilizzando preparazioni di insulina di diversa durata d'azione. La scelta del farmaco dipende dalla gravità e dalle caratteristiche del decorso della malattia, dalle condizioni generali del paziente e dalla velocità di insorgenza e dalla durata dell'azione di abbassamento dello zucchero del farmaco.

Tutti i preparati a base di insulina vengono utilizzati in conformità al regime alimentare con una limitazione del valore energetico del cibo (da 1.700 a 3.000 kcal).

Nel determinare la dose di insulina, sono guidati dal livello di glucosio a digiuno e durante il giorno, così come il livello di glicosuria durante il giorno. La selezione della dose finale viene effettuata sotto il controllo della riduzione dell'iperglicemia, della glicosuria e delle condizioni generali del paziente.

Controindicazioni. L'insulina è controindicata in malattie e condizioni che si verificano con l'ipoglicemia (ad esempio l'insulinoma), nelle malattie acute del fegato, pancreas, reni, ulcere gastriche e duodenali, difetti cardiaci scompensati, nell'insufficienza coronarica acuta e in alcune altre malattie.

Utilizzare durante la gravidanza. Il principale trattamento farmacologico per il diabete mellito durante la gravidanza è la terapia insulinica, che viene effettuata sotto stretta supervisione. In caso di diabete mellito di tipo 1, il trattamento con insulina viene continuato. In caso di diabete mellito di tipo 2, i farmaci ipoglicemici orali vengono cancellati e viene praticata la terapia dietetica.

Il diabete mellito gestazionale (diabete gravido) è un disturbo del metabolismo dei carboidrati che si è verificato per la prima volta durante la gravidanza. Il diabete mellito gestazionale è associato ad un aumentato rischio di mortalità perinatale, all'incidenza di malformazioni congenite e al rischio di progressione del diabete 5-10 anni dopo il parto. Il trattamento del diabete gestazionale inizia con la dieta. Se la terapia dietetica è inefficace, viene utilizzata l'insulina.

Per i pazienti con diabete mellito preesistente o gestazionale, è importante mantenere un'adeguata regolazione dei processi metabolici durante la gravidanza. La necessità di insulina può diminuire nel primo trimestre di gravidanza e aumentare nel secondo e terzo trimestre. Durante il parto e immediatamente dopo di loro, la necessità di insulina può diminuire drasticamente (aumenta il rischio di ipoglicemia). In queste condizioni, è essenziale un attento monitoraggio della glicemia.

L'insulina non penetra la barriera placentare. Tuttavia, gli anticorpi IgG materni verso l'insulina passano attraverso la placenta e possono causare iperglicemia nel feto neutralizzando l'insulina secreta da esso. D'altra parte, la dissociazione indesiderabile dell'insulina - complessi di anticorpi può portare a iperinsulinemia e ipoglicemia nel feto o nel neonato. È stato dimostrato che la transizione dai preparati di insulina bovina / suina ai preparati monocomponenti è accompagnata da una diminuzione del titolo anticorpale. A questo proposito, durante la gravidanza, si raccomanda di usare solo preparati di insulina umana.

Gli analoghi dell'insulina (come altri agenti di recente sviluppo) vengono prescritti con cautela durante la gravidanza, sebbene non vi siano prove affidabili degli effetti avversi. Conformemente alle raccomandazioni generalmente accettate dalla FDA (Food and Drug Administration), che determinano la possibilità di utilizzare droghe durante la gravidanza, i preparati insulinici per l'effetto sul feto rientrano nella categoria B (lo studio della riproduzione sugli animali non ha rivelato effetti avversi sul feto e studi adeguati e strettamente controllati in donne in gravidanza donne non sono state condotte) o alla categoria C (gli studi sulla riproduzione animale hanno rivelato un effetto avverso sul feto e non sono stati condotti studi adeguati e ben controllati in donne in gravidanza, ma i potenziali benefici associati all'uso di droghe in donne in gravidanza possono giustificarne l'uso, nonostante il possibile rischio). Quindi l'insulina lizpro appartiene alla classe B e l'insulina aspart e l'insulina glargine alla classe C.

Complicazioni della terapia insulinica. L'ipoglicemia. L'introduzione di dosi troppo elevate, così come la mancanza di assunzione di carboidrati con il cibo può causare uno stato ipoglicemico indesiderabile, un coma ipoglicemico può svilupparsi con perdita di coscienza, convulsioni e depressione dell'attività cardiaca. L'ipoglicemia può anche svilupparsi a causa dell'azione di ulteriori fattori che aumentano la sensibilità all'insulina (ad esempio, insufficienza surrenalica, ipopituitarismo) o aumentano l'assorbimento tissutale del glucosio (esercizio fisico).

I primi sintomi di ipoglicemia, che sono in gran parte associati all'attivazione del sistema nervoso simpatico (sintomi adrenergici) comprendono tachicardia, sudore freddo, tremori, con l'attivazione del sistema parasimpatico: fame grave, nausea e formicolio alle labbra e alla lingua. Al primo segno di ipoglicemia, devono essere prese misure urgenti: il paziente deve bere tè dolce o mangiare qualche pezzo di zucchero. Nel coma ipoglicemico, una soluzione di glucosio al 40% in una quantità di 20-40 ml o più viene iniettata in una vena fino a quando il paziente non lascia lo stato comatoso (di solito non più di 100 ml). L'ipoglicemia può anche essere rimossa mediante somministrazione intramuscolare o sottocutanea di glucagone.

Un aumento del peso corporeo durante la terapia insulinica è associato all'eliminazione della glucosuria, all'aumento del contenuto calorico effettivo del cibo, all'aumento dell'appetito e alla stimolazione della lipogenesi sotto l'azione dell'insulina. Se segui i principi della nutrizione, questo effetto collaterale può essere evitato.

L'uso di moderni farmaci ormonali altamente purificati (in particolare preparati di insulina umana geneticamente modificati) porta relativamente raramente all'insulino resistenza e allergie, ma tali casi non sono esclusi. Lo sviluppo di una reazione allergica acuta richiede una terapia desensibilizzante immediata e la sostituzione del farmaco. Quando si sviluppa una reazione ai preparati di insulina bovina / suina, questi devono essere sostituiti con preparati di insulina umana. Reazioni locali e sistemiche (prurito, rash locale o sistemico, formazione di noduli sottocutanei nel sito di iniezione) sono associate ad una inadeguata purificazione dell'insulina da impurità o all'uso di insulina bovina o suina, che differiscono nella sequenza di amminoacidi da quella umana.

Le reazioni allergiche più frequenti sono la pelle, gli anticorpi IgE-mediati. Occasionalmente si osservano reazioni allergiche sistemiche e resistenza insulinica mediata dagli anticorpi IgG.

Visione offuscata I disturbi transitori della rifrazione dell'occhio si verificano all'inizio della terapia insulinica e scompaiono da soli in 2-3 settimane.

Gonfiore. Nelle prime settimane di terapia, l'edema transitorio delle gambe si verifica anche a causa della ritenzione di liquidi, il cosiddetto. gonfiore di insulina.

Le reazioni locali includono la lipodistrofia nel sito di iniezioni ripetute (una rara complicazione). Assegni lipoatrofia (la scomparsa dei depositi di grasso sottocutaneo) e lipoipertrofia (aumento del deposito di grasso sottocutaneo). Questi due stati hanno una natura diversa. Lipoatrofia - una reazione immunologica, principalmente dovuta alla somministrazione di preparati insulinici scarsamente purificati di origine animale, non è stata praticamente trovata. La lipoipertrofia si sviluppa con l'uso di preparati di insulina umana altamente purificati e può verificarsi se la tecnica di iniezione è disturbata (preparazione a freddo, l'alcol entra sotto la pelle), e anche a causa dell'azione anabolica locale del preparato stesso. Lipoipertrofia crea un difetto estetico che è un problema per i pazienti. Inoltre, a causa di questo difetto, l'assorbimento del farmaco è compromesso. Per prevenire lo sviluppo della lipoipertrofia, si raccomanda di cambiare costantemente i siti di iniezione all'interno della stessa area, lasciando almeno 1 cm tra due punture.

Ci possono essere reazioni locali come dolore nel sito di somministrazione.

Interazione. I preparati a base di insulina possono essere combinati tra loro. Molti farmaci possono causare ipo o iperglicemia o modificare la reazione di un paziente con diabete mellito al trattamento. Dovresti considerare l'interazione, possibile con l'uso simultaneo di insulina con altri farmaci. Alfa-bloccanti e beta-adrenomimetiki aumentano la secrezione di insulina endogena e aumentano l'effetto del farmaco. effetto ipoglicemizzante dell'insulina migliorare agenti orali ipoglicemizzanti, salicilati, inibitori MAO (compresi furazolidone, procarbazina, selegilina), ACE inibitori, bromocriptina, octreotide, sulfamidici, steroidi anabolizzanti (specialmente ossandrolone, methandienone) e androgeni (aumento della sensibilità all'insulina e aumentare la resistenza del tessuto al glucagone, che porta all'ipoglicemia, specialmente nel caso di insulino-resistenza, potrebbe essere necessario ridurre la dose di insulina), analoghi della somatostatina, guanetidina, dizo piramidi, clofibrato, ketoconazolo, preparazioni al litio, mebendazolo, pentamidina, piridossina, propossifene, fenilbutazone, fluoxetina, teofillina, fenfluramina, preparazioni al litio, preparazioni di calcio, tetracicline. Chlorochina, chinidina, chinina riducono la degradazione dell'insulina e possono aumentare la concentrazione di insulina nel sangue e aumentare il rischio di ipoglicemia.

Gli inibitori di carboanidrasi (specialmente acetazolamide), stimolando le β-cellule pancreatiche, promuovono il rilascio di insulina e aumentano la sensibilità dei recettori e dei tessuti all'insulina; sebbene l'uso simultaneo di questi farmaci con insulina possa aumentare l'effetto ipoglicemico, l'effetto può essere imprevedibile.

Un numero di farmaci causa iperglicemia in persone sane e aggravano il decorso della malattia nei pazienti con diabete. L'effetto ipoglicemico dell'insulina è indebolito: farmaci antiretrovirali, asparaginasi, contraccettivi ormonali orali, glucocorticoidi, diuretici (tiazidico, acido etacrinico), eparina, antagonisti H₂-recettori, sulfinpirazone, antidepressivi triciclici, dobutamina, isoniazide, calcitonina, niacina, simpaticomimetici, danazolo, clonidina, BCC, diazossido, morfina, fenitoina, ormone della crescita, ormoni tiroidei, derivati ​​fenotiazinici, nicotina, etanolo.

I glucocorticoidi e l'epinefrina hanno l'effetto opposto all'insulina sui tessuti periferici. Pertanto, la somministrazione a lungo termine di glucocorticoidi sistemici può causare iperglicemia, fino al diabete mellito incluso (diabete steroideo), che può verificarsi in circa il 14% dei pazienti che assumono corticosteroidi sistemici per diverse settimane o con uso a lungo termine di corticosteroidi topici. Alcuni farmaci inibiscono la secrezione di insulina direttamente (fenitoina, clonidina, diltiazem) o riducendo le riserve di potassio (diuretici). Gli ormoni tiroidei accelerano il metabolismo dell'insulina.

Il più significativo e spesso influenzano l'azione dei beta-bloccanti dell'insulina, degli agenti ipoglicemici orali, dei glucocorticoidi, dell'etanolo, dei salicilati.

L'etanolo inibisce la gluconeogenesi nel fegato. Questo effetto è osservato in tutte le persone. A questo proposito, va tenuto presente che l'abuso di bevande alcoliche sullo sfondo della terapia insulinica può portare allo sviluppo di uno stato ipoglicemico grave. Piccole quantità di alcol assunto con il cibo di solito non causano problemi.

I beta-bloccanti possono inibire la secrezione di insulina, alterare il metabolismo dei carboidrati e aumentare la resistenza periferica all'insulina, che porta all'iperglicemia. Tuttavia, possono anche inibire l'effetto delle catecolamine sulla gluconeogenesi e sulla glicogenolisi, che è associato al rischio di gravi reazioni ipoglicemiche nei pazienti diabetici. Inoltre, uno qualsiasi dei beta-bloccanti adrenergici può mascherare i sintomi adrenergici causati da una diminuzione dei livelli di glucosio nel sangue (compreso tremori, palpitazioni), interrompendo così il riconoscimento tempestivo del paziente dell'ipoglicemia. Beta selettivo₁-i bloccanti adrenergici (inclusi acebutololo, atenololo, betaxololo, bisoprololo, metoprololo) mostrano questi effetti in misura minore.

I FANS e i salicilati ad alte dosi inibiscono la sintesi della prostaglandina E (che inibisce la secrezione di insulina endogena) e quindi aumentano la secrezione basale di insulina, aumentano la sensibilità delle cellule beta del pancreas al glucosio; l'effetto ipoglicemico con l'uso simultaneo può richiedere un aggiustamento della dose di FANS o salicilati e / o insulina, specialmente se si condivide a lungo termine.

Un numero significativo di preparazioni di insulina sono attualmente in produzione, incl. derivato dal pancreas degli animali e sintetizzato dall'ingegneria genetica. I preparativi di scelta per la terapia insulinica sono le insuline umane altamente purificate e geneticamente modificate con antigenicità minima (attività immunogenica), nonché analoghi dell'insulina umana.

Le preparazioni di insulina sono prodotte in flaconcini di vetro, sigillati ermeticamente con tappi di gomma con funzionamento in alluminio, in speciali cosiddetti. siringhe per insulina o penne a siringa. Quando si usano le penne a siringa, i preparati sono in speciali cartucce per fiale (penfill).

Si stanno sviluppando forme intranasali di insulina e preparazioni di insulina per somministrazione orale. Con la combinazione di insulina con un detergente e somministrazione sotto forma di un aerosol sulla mucosa nasale, il livello plasmatico effettivo viene raggiunto con la stessa rapidità con la somministrazione di bolo ev. Preparazioni di insulina intranasale e orale sono in fase di sviluppo o in fase di sperimentazione clinica.