Tecnologia di produzione dell'insulina

  • Analisi

L'insulina è uno degli ormoni prodotti dal corpo umano stesso, in particolare dal pancreas. La violazione della secrezione di questa sostanza porta alla comparsa di una malattia così grave come il diabete. Per il suo trattamento utilizzando un ormone sintetico, che per lungo tempo isolato dal pancreas del bestiame. Tuttavia, la tecnologia per produrre insulina con l'aiuto di un batterio molto comune - l'Escherichia coli o il fungo del lievito è stata usata per un periodo piuttosto lungo. L'utilizzo di questo metodo consente di evitare reazioni allergiche causate da proteine ​​estranee, che ha una leggera differenza rispetto all'uomo.

Schema tecnologico

La tecnologia di produzione dell'insulina include tutte le fasi principali della produzione di prodotti biotech. Il risultato è un prodotto finale cristallino, che viene poi utilizzato per preparare soluzioni di iniezione utilizzate nel trattamento del diabete mellito grave tipo I e II. L'effetto principale di questo ormone nel corpo si manifesta in una diminuzione del livello di glucosio contenuto nel sangue.

Le fasi della produzione di insulina saranno le seguenti:

  • Preliminare. Svolge operazioni come la preparazione e la purificazione di acqua e aria, la pulizia di locali industriali e la sterilizzazione di attrezzature, l'ispezione del personale, la lavorazione delle mani e l'emissione di scarpe e indumenti sterili. Inoltre, nella fase preliminare, viene effettuata la sintesi chimica primaria delle catene molecolari da cui viene assemblata la proteina. La catena A contiene 21 residui di amminoacidi e la catena B contiene 30 amminoacidi.
  • Preparazione di soluzioni nutritive e colture cellulari. Per fare in modo che una cellula vivente produca il composto necessario, viene introdotto il gene corrispondente. Per questo, il plasmide viene tagliato da speciali enzimi, restrizioni e vengono codificati i geni che codificano la sintesi dei composti necessari. Quindi, utilizzando un metodo di microiniezione, il plasmide modificato viene restituito alla cella.
  • Coltivazione della sospensione cellulare. Le cellule geneticamente modificate sono poste in una soluzione nutritiva, con tutti gli ingredienti necessari per la crescita e la riproduzione e in fase di sterilizzazione. La coltivazione della cultura avviene in speciali bioreattori, dove viene alimentata l'aria pre-purificata. Periodicamente una certa quantità di soluzione nutritiva viene aggiunta al reattore e allo stesso tempo viene ritirato lo stesso volume di sospensione cellulare.
  • L'allocazione della cultura. La separazione del fluido e della coltura cellulare viene effettuata mediante sedimentazione (sedimentazione) in speciali sedimentatori e quindi filtrazione, che consente di preservare l'integrità delle cellule.
  • Purificazione cromatografica della sostanza. Viene eseguita sull'attrezzatura appropriata, utilizzando vari metodi, in particolare cromatografia di permeazione frontale, scambio di anioni e gel.
  • Ottenere una molecola proteica. Allo stadio attuale della biotecnologia, si verifica la sintesi di una molecola insulinica insulsa. E i due componenti delle sue catene. Sono cuciti dopo l'ossidazione e la piegatura delle catene ottenute, con la conseguente formazione di ponti disolfuro.
  • Liofilizzazione in un forno speciale, dopo il quale la preparazione cristallina risultante viene controllata per conformità con lo standard, confezionato, etichettato e spedito al consumatore.

La nostra azienda a condizioni favorevoli offre linee di produzione già pronte, dove tutta la tecnologia della produzione di insulina è pienamente rispettata. Grazie a calcoli precisi, supporto tecnico e informativo e formazione del personale nel quadro di un programma completo, la società sarà redditizia e i suoi prodotti saranno richiesti.

Scoperta di insulina

Oggi il diabete colpisce oltre 400 milioni di persone sul pianeta, che rappresenta circa l'8% della popolazione adulta del globo. Secondo il registro statale, più di 3,3 milioni di persone soffrono di diabete in Russia (circa 300 mila persone soffrono di diabete di tipo 1 e circa 3 milioni di persone soffrono di diabete di tipo 2). Tuttavia, è improbabile che queste cifre riflettano la situazione reale. Tutte queste persone, vivendo ogni giorno, capiscono che la loro vita dipende dall'insulina.

I primi tentativi di curare il diabete sono stati fatti prima della nostra era. Medici antichi greci e romani utilizzati per questo massaggio, ginnastica, bagni, aromaterapia e molto altro ancora. Nel 19 ° secolo, una dieta a basso contenuto di carboidrati è stata sviluppata per i diabetici. Il primo tentativo di trattare il diabete con iniezioni di insulina è stato fatto nel 1921. Lo scienziato canadese Frederick Banting è stato il primo a utilizzare l'ormone dell'insulina per controllare il diabete. Aveva solo 32 codici quando ha ricevuto il premio Nobel per la medicina. Ha creato il farmaco in modo efficace e senza effetti collaterali ha ridotto il livello di glucosio da 28,9 a 6,7 ​​mmol / l. Questa droga ha dato speranza per la vita a molti.

Nel 1869, lo scienziato Paul Langergans scoprì gruppi di cellule nel pancreas, che in seguito furono intitolate a lui "le isole di Langerhans". L'insulina è stata successivamente isolata dalle cellule di queste isole. L'insulina è un ormone che regola il metabolismo, principalmente di carboidrati (zuccheri), ma anche grassi e proteine. Nel diabete a causa dell'insufficiente esposizione all'insulina, si verifica un disordine metabolico complesso, il livello di zucchero nel sangue aumenta (iperglicemia), lo zucchero viene escreto nelle urine (glicosuria) e i prodotti acidi di combustione ipoglicemica appaiono nei corpi sanguigni chetonici (chetoacidosi).

Dopo la scoperta di insulina, molti scienziati hanno iniziato a sviluppare metodi per pulire questo farmaco, dal momento che sono impurità che hanno un effetto dannoso su un corpo indebolito.

Agilent Technologies è il leader mondiale nelle apparecchiature analitiche. I dispositivi per l'analisi cromatografica e spettrale da oltre un anno hanno aiutato gli scienziati di tutto il mondo a risolvere i problemi vitali dei prodotti farmaceutici. Il controllo della purezza dell'insulina non fa eccezione. In precedenza, la cromatografia liquida classica veniva utilizzata per questi scopi, pur ottenendo risultati abbastanza accettabili:

Dopo molte ricerche, gli scienziati hanno dimostrato che il polipeptide dell'insulina formato con un peso molecolare di circa 6000, è efficacemente identificato utilizzando gli ultimi sviluppi nel campo della cromatografia di esclusione.

Con questo nuovo metodo, si può paragonare "buona insulina", che è stata conservata nelle condizioni raccomandate e "cattiva insulina". Quando due cromatogrammi sono stati sovrapposti l'uno sull'altro, è risultato che nella preparazione dell'insulina, che è stata conservata in condizioni avverse, la molecola bersaglio è stata distrutta e invece di essa, i prodotti di decomposizione sono stati identificati sul cromatogramma.

Sviluppo e unificazione di metodi per l'analisi e la standardizzazione di preparati di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione a fase inversa (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

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Pihtar Anatoly Vasilyevich. Sviluppo e unificazione di metodi per l'analisi e la standardizzazione di preparati di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione a fase inversa (RP HPLC): tesi. Candidato di Scienze farmaceutiche: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Luogo di protezione: Accademia Medica di Mosca "].- Mosca, 2005.- 139 pp.: Il.

Contenuto per la tesi

CAPITOLO 1. Revisione della letteratura 11

1. Il ruolo dell'insulina nel trattamento del diabete mellito 11

2. Biosintesi e azione biologica dell'insulina 12

3. Caratteristiche generali delle proprietà fisico-chimiche e farmaceutiche dell'insulina 15

4. Preparazioni di insulina 24

5. Metodi di produzione, standardizzazione e controllo di qualità delle preparazioni di insulina 31

6. L'uso di HPLC nell'analisi farmaceutica dell'insulina. 46

CAPITOLO 2. Dichiarazione di problema 50

CAPITOLO 3. Studio dell'influenza di vari fattori sul comportamento cromatografico dell'insulina nelle condizioni di RP HPLC 56

1. Metodi e materiali 57

2. Discussione dei risultati 62

2.1. L'influenza della composizione della soluzione tampone 62

2.2. L'effetto della concentrazione di sodio solfato 68

2.3. Effetto della temperatura della colonna cromatografica 70

2.4. Effetto del modificatore organico 75

2.5. L'influenza della lunghezza del radicale alchilico della fase innestata 80

2.6. L'influenza della lunghezza della colonna cromatografica 80

CAPITOLO 4. Miglioramento dei metodi farmacologici per l'analisi dei preparati insulinici basati sull'uso di RP HPLC 82

1. Selezione delle condizioni ottimali per la determinazione cromatografica dell'insulina e delle sue impurità nelle preparazioni medicinali 82

2. Caratteristiche metrologiche del metodo 84

3. Applicazione della metodologia sviluppata per testare i preparati ufficiali di insulina 95

CAPITOLO 5. Sviluppo di metodi per l'analisi di forme di dosaggio iniettabili di isofano-insulina basate sul metodo HPLC PF 107

1. La scelta delle condizioni per la determinazione cromatografica della protamina nelle forme di dosaggio di isofano-insulina 110

2. Studio dei profili cromatografici di protamine isolate da varie specie ittiche 121

3. Metodo per la determinazione della protamina nelle preparazioni di insulina isofano 123

4. Validazione della metodologia sviluppata 125

Conclusioni generali 136

Riferimenti 139

Caratteristiche generali delle proprietà fisico-chimiche e farmaceutiche dell'insulina

Da un punto di vista chimico, l'insulina è una piccola proteina globulare con un peso molecolare fino a 6000 Da. Allo stesso tempo, va notato che l'insulina è un nome comune per un'intera famiglia di proteine ​​omologhe di origine naturale e artificiale con un'attività biologica caratteristica comune. La natura proteica dell'insulina è stata stabilita nel 1928 [52]. È tra le proteine ​​che producono la reazione del biureto e la reazione di Pauli. La struttura dell'insulina è stata completamente stabilita nei primi anni '50. La composizione chimica elementare delle insuline di varia origine è caratterizzata dalle cifre riportate nella tabella 1 [40].

Composizione di aminoacidi La maggior parte delle molecole di insulina contiene 51 residui di amminoacidi, tra cui 17 aminoacidi trovati nelle proteine ​​più note.

Una caratteristica della composizione aminoacidica dell'insulina bovina, porcina e umana è il triptofano e la metionina. La composizione aminoacidica di questi tipi di insulina è presentata nella tabella 2 [40,46].

Invariabile a tutti i tipi di insulina è il contenuto di cistina (6 residui di mezzo cistina). Inoltre, la molecola di insulina di tutti i tipi contiene 6 gruppi ammidici (asparagina, glutammina).

Quando l'insulina viene rilasciata, insieme alla frazione principale, si possono osservare frazioni di forme deammidificate di insulina. Nell'ambiente acido, nel processo di deammidazione, tutti i 6 gruppi ammidici possono essere gradualmente separati e la mobilità elettroforetica e cromatografica dei cambiamenti dell'insulina [40]. La formazione di forme deammidificate di insulina può essere giudicata dai risultati della determinazione dell'ammoniaca. Per la forma completamente ammide di insulina, vengono determinati 6 moli di ammoniaca per 1 moli di proteina, per le forme deammidate questo valore può essere compreso tra 5 e 0.

La struttura primaria di insulina. La struttura primaria dell'insulina è stata decifrata dal gruppo Sanger nel 1945-1955. Utilizzando un numero di metodi cromatografici che hanno reso possibile la separazione e l'identificazione di vari peptidi, amminoacidi e loro derivati, Sanger è stato in grado di stabilire la struttura primaria dell'insulina bovina [130,131,132,133,134,135]. Ulteriori studi su insuline di varia origine utilizzando una varietà di metodi fisico-chimici, incluso il metodo Edman per determinare la sequenza completa di amminoacidi in peptidi lunghi, hanno confermato i risultati di Sanger e dei suoi coautori sulla struttura dell'insulina [bb].

Ad oggi, la struttura primaria dell'insulina è stata determinata in rappresentanti di 24 specie appartenenti a 4 classi di animali: mammiferi, uccelli, pesci e ciclostomi [14]. La ricerca su insulina di varia origine continua [71,72,73].

La struttura dell'insulina in diversi animali è simile, ma non identica. Nella sua struttura primaria, l'insulina umana è simile alle insuline di maiale, cane, capodoglio e coniglio, differendo solo in un amminoacido [40]. Si differenzia dall'insulina bovina da tre aminoacidi. In misura maggiore, l'insulina umana non è simile all'insulina del maiale, degli uccelli e dei pesci della Guinea [40]. Le differenze nella sequenza aminoacidica di insuline umane, suine e bovine sono mostrate nella Tabella 3.

Nonostante le differenze strutturali, tutti i tipi di insulina hanno un'attività biologica simile, vale a dire causa l'effetto ipoglicemico. Tuttavia, l'entità dell'attività biologica visualizzata dipende fortemente dalla specie e si trova nell'intervallo di 11 UI / mg (insulina di merluzzo dal Mare del Nord) a 62 UI / mg (insulina di tacchino e pollo), mentre l'attività dell'insulina umana è di circa 25-30 UI / mg [40]. Maggiore è la differenza interspecie, maggiore è la differenza nell'attività biologica dell'insulina corrispondente.

Una molecola di insulina funzionalmente attiva è costituita da due catene di polipeptidi (catene A e B) collegate da legami disolfuro; un legame è formato dal settimo residuo amminoacidico di entrambe le catene, il secondo legame disolfuro è formato dal 20 ° residuo della catena A e dal 19 ° residuo della catena B (Figura 2). Inoltre, vi è un terzo legame disolfuro nella molecola di insulina, che è l'intrachain e collega i residui della sesta catena A e della 6a catena [59,117].

Struttura secondaria Utilizzando vari metodi di ricerca fisico-chimica e fisica, è stato dimostrato che la molecola di insulina ha una struttura spaziale altamente ordinata (conformazione), che contribuisce all'implementazione di specifiche funzioni biologiche [14]. Nella molecola dell'insulina nativa, entrambi i fogli cc-helix e p-fold sono presenti simultaneamente. Inoltre, ci sono aree con struttura e struttura disordinata <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Quando una soluzione acida di insulina (pH 2,3-2,5) viene riscaldata a una temperatura di +100 ° C e rapidamente raffreddata a -80 ° C, si forma la cosiddetta insulina fibrillare - una forma completamente inattiva dell'ormone [27]. L'introduzione di fibre di insulina fibrillare in una soluzione di insulina attiva causa la precipitazione quantitativa spontanea di insulina sotto forma di fibrille [14,17].

Metodi di produzione, standardizzazione e controllo di qualità delle preparazioni di insulina

Ottenere specie di insulina animale. La produzione industriale di insulina di manzo e di maiale fu stabilita quasi contemporaneamente in un certo numero di paesi, subito dopo la scoperta di insulina nel 1921 [63]. Da allora, il concetto di ottenere insulina è rimasto praticamente invariato (tabella b) [17, 18]. Le materie prime per la produzione di specie animali di insulina sono il pancreas del bestiame da macello utilizzato per il cibo.

Il compito più importante nella produzione di insulina è la sua depurazione - il rilascio di sostanze dalle impurità correlate, che riducono l'attività biologica, causano reazioni immunologiche o sono potenzialmente pericolose per la salute del paziente. Ad esempio, dopo diversi anni di utilizzo dell'insulina non purificata nel sangue del paziente, possono esserci fino a 5.000 UI di insulina legata agli anticorpi. Gli anticorpi anti-insulina influenzano in modo significativo il profilo della sua azione e, quindi, contribuiscono al corso labile del diabete.

Il primo metodo di purificazione dell'insulina era la ricristallizzazione in presenza di sali di zinco. Nel 1945, è stato dimostrato che la ricristallizzazione settupla di insulina riduce significativamente il livello delle reazioni allergiche nei pazienti, rispetto ai preparati insulinici ufficiali in quel momento [63].

L'eterogeneità dei campioni di insulina dopo la cristallizzazione e la ricristallizzazione singola viene mostrata utilizzando una varietà di metodi: estrazione controcorrente (PE), cromatografia di distribuzione (PX), cromatografia a scambio ionico (IOC), diskelectrophoresis (DEP) e cromatografia a esclusione di gel (GEC) [63].

È stato riscontrato che le principali impurità concomitanti di insulina sono: proinsulina, suoi intermedi, dimero dell'insulina covalente, insulina mono-disamidale, monoarginina e monoetilene, nonché un numero di composti altamente molecolari di natura non insulinica. Una conclusione generalizzata dai risultati degli studi, tenendo conto delle informazioni sull'attività immunologica delle impurità rilevate [138], è stata la conclusione sulla necessità di una ulteriore purificazione delle sostanze insuliniche, in modo che durante l'analisi con metodi DEF e GEC, è stato trovato un componente - l'insulina corrispondente.

Per risolvere il problema della purificazione dell'insulina nel 1950, fu proposto il metodo HEC e, nel 1970, il metodo della cromatografia a scambio anionico (AOX). È stato riscontrato che l'insulina, purificata con il metodo AOX, contiene circa 500 ppm (parti per milione) di impurità con attività proinsulinica [137]. La purificazione aggiuntiva di insulina mediante cromatografia liquida ad alta pressione su fasi invertite (RP HPLC) riduce il contenuto di frazioni immunogeniche al limite del loro rilevamento [63].

Una rassegna degli attuali sviluppi nel campo della purificazione cromatografica dell'insulina è presentata in [96]. L'insulina, purificata, sequenzialmente, usando IOC e GEC, è chiamata insulina monocomponente [63]. Ottenere l'insulina umana. La ricerca di metodi per ottenere l'insulina umana era dovuta a due circostanze. Da un lato, l'urgenza del problema delle materie prime nel caso della produzione di insulina animale, dall'altro, il rapido sviluppo della scienza in quest'area ha fornito una reale opportunità per dare vita all'idea. Nel 1979 e nel 1981 quasi contemporaneamente, sono stati sviluppati due metodi per ottenere l'insulina umana - biosintetici e semi-sintetici [102,108]. Nel 1981, la società Novo Nordisk per la prima volta nel mondo iniziò la produzione seriale di insulina semisintetica umana. Il metodo utilizzato dalla società si basa sulla sostituzione enzimatica e chimica di Al nella molecola di insulina suina con il resto di Tre [61]. Questo metodo dipende direttamente dall'ottenimento della quantità necessaria di insulina porcina, che riduce il suo valore economico. La possibilità di ottenere l'insulina umana mediante il metodo biosintetico è apparsa con lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante [10]. La produzione di insulina geneticamente modificata è iniziata circa 25 anni fa. Nel 1978, fu riportato che un ceppo di E. coli che produceva la procura di ratto era ottenuto. Nel 1979, gli studi di Genentech furono in grado di clonare in E. coli i geni che codificano per sequenze di amminoacidi. catene di insulina A e B incluse nella regione p-halo-tacidasi del plasmide pBR322 [10,102]. Nel 1981, un analogo del gene della proinsulina della mini-C-proinsulina fu sintetizzato, in cui il peptide C a 35 membri fu sostituito da un segmento di sei amminoacidi: arg-arg-gly-ser-lys-arg e fu mostrata la sua espressione in E. coli. Nel 1982, la società Eli Lilly ha iniziato la prima produzione industriale mondiale di insulina umana utilizzando due tecnologie a catena sviluppate in collaborazione con Genentech [102]. Attualmente, è stata dimostrata la possibilità di ottenere insulina umana con l'aiuto di vari sistemi di espressione [3,10,101,102]. Da un punto di vista economico, l'uso di ceppi geneticamente modificati di batteri E.coli gram-positivi, molti dei quali sono considerati sovraproduttori, è di particolare interesse [3]. Allo stesso tempo, sono stati ottenuti progressi significativi con le cellule di lievito Saccharomices cerevisiae [3.75]. La Tabella 7 elenca i principali, comuni ai vari metodi di produzione dell'insulina umana ricombinante, le fasi del processo tecnologico [3,10,63].

Applicazione della metodologia sviluppata per testare i preparati ufficiali di insulina

La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è una variante della cromatografia liquida di colonna in cui l'eluente fase mobile passa attraverso il sorbente che riempie la colonna ad alta velocità a causa di una pressione significativa (fino a 400x105 Pa) all'ingresso della colonna [11].

Come metodo per analizzare miscele complesse di sostanze, l'HPLC è comparsa poco più di 30 anni fa. L'uso di assorbenti con un diametro delle particelle di 3-10 μm ha causato un netto aumento dell'efficienza della separazione cromatografica rispetto alla versione classica della cromatografia liquida su colonna. Pertanto, l'HPLC viene spesso definita cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Le caratteristiche strumentali dell'uso dell'HPLC sono descritte in dettaglio in numerosi manuali [49.50] e nelle sezioni pertinenti della farmacopea principale [79, 150]. Per l'HPLC è stata sviluppata e prodotta una vasta gamma di sorbenti. Secondo gli autori del sondaggio [51] - circa 100 aziende in tutto il mondo producono più di 300 tipi di nomi di sorbenti. La storia, lo stato attuale e le prospettive per lo sviluppo del metodo sono discussi nelle recensioni [51] e [77.78].

Nelle sue varie varianti, il metodo HPLC è ampiamente utilizzato nell'analisi farmaceutica (controllo della produzione e test della qualità dei farmaci). Il metodo è incluso in tutte le principali farmacopee del mondo. Questo metodo è descritto in modo completo nelle Farmacopee europee e americane. L'HPLC viene utilizzato per identificare i farmaci, per determinare la purezza, la composizione frazionaria del peso molecolare e l'analisi quantitativa. Nella farmacopea degli Stati Uniti 28 ed. circa il 30% degli articoli privati ​​riguarda l'uso di HPLC. Nella Farmacopea Europea 4 ° ed. questa cifra è di circa il 40%.

Il primo metodo cromatografico per il test dell'insulina era la cromatografia liquida ad esclusione di gel a bassa pressione (GE ZhND). Il principio di separazione nelle condizioni dell'HPLC si basa sulla diversa capacità delle molecole di diverse dimensioni di penetrare nei pori del gel neutro, che funge da fase stazionaria. Il diametro idrodinamico del monomero di insulina e dimero è proporzionale al loro peso molecolare ed è 2,69 e 5,50 nm, rispettivamente [115].

Nel 1967, utilizzando il metodo GE-IHDD, è stato dimostrato che le preparazioni commerciali di insulina, purificate per cristallizzazione, contengono impurezze con un peso molecolare che supera il peso molecolare dell'insulina [63]. Sui cromatogrammi dell'insulina suina sono stati trovati tre picchi, convenzionalmente designati come componenti a-, b- e c. Da allora, un certo numero di sistemi cromatografici sono stati proposti per controllare il contenuto di impurezze ad alto peso molecolare in preparazioni di insulina. La separazione è stata effettuata su xerogel di agarosio altamente rigonfianti (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) O destrano (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), sono state utilizzate soluzioni da 1-3 M di acido acetico come IF [127]. L'alta sensibilità di questi assorbenti alla compressione a pressioni che superano la pressione di rigonfiamento della matrice rende questi materiali inadatti per il funzionamento in modalità HPLC.

L'uso della cromatografia liquida ad esclusione di gel ad alte pressioni (GE HPLC) per l'analisi dell'insulina è stato descritto per la prima volta nel 1980, dopo lo sviluppo di sorbenti macroporosi rigidi compatibili con l'acqua e resistenti alle alte pressioni. In [151], la separazione è stata effettuata su colonne Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-Gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) in condizioni denaturanti (combinazione di soluzione 7 M di urea, acidi minerali e non ionici detergenti). La necessità di analisi dell'insulina in condizioni denaturanti è associata alla capacità dell'insulina di aggregarsi in soluzione. Per la separazione di insulina nelle condizioni dell'HPLC HPLC, è stato anche descritto l'uso dell'acido acetico "tradizionale" eluente [152]. L'uso dell'acido acetico ha diversi vantaggi: l'impatto minimo sulla struttura nativa dei composti separati, la disponibilità, il basso costo, inoltre, un fatto importante è la capacità dell'acido acetico di sopprimere l'associazione dell'insulina.

Attualmente, GE HPLC è un metodo farmacopea per monitorare il contenuto di impurità ad alto peso molecolare in sostanze e forme di dosaggio finito. Il metodo viene anche utilizzato per determinare il contenuto di protamina nelle preparazioni di insulina isofano.

L'uso dell'HPLC su fasi inverse (RP HPLC) per la separazione dell'insulina bovina e suina per la prima volta ha dimostrato l'elevata efficacia di questo metodo per l'analisi di peptidi insulino-simili con una struttura simile.

Il meccanismo di separazione delle proteine ​​e dei polipeptidi nelle condizioni di RP HPLC si basa sulla diversa idrofobicità delle molecole di insulina e delle relative impurità. Ad oggi, sono state descritte diverse dozzine di metodi per la separazione cromatografica di insulina di varia origine e dei loro derivati, tra cui proinsolfato, polipeptidi pancreatici, derivati ​​del dezamido, dimero dell'insulina. [126] ha mostrato la possibilità di separare l'insulina di pollo, coniglio, pecora e cavallo. Sono stati inoltre separati l'insulina umana, di manzo e di maiale. Lloyd e Corran pubblicarono un metodo per separare manzo, maiale, insuline umane e le loro corrispondenti forme deammidate [104].

La separazione viene eseguita su gruppi di sorbenti di gel di silice modificati, metilici, butilici, ottilici, ottadecilici e fenilici in modalità isocratica o gradiente. Come PF, vengono utilizzati modificatori organici - acetonitrile, alcol metilico, alcol isopropilico, miscelati con soluzioni tampone acquose contenenti sali inorganici e reagenti a vapore di ioni. Il rilevamento del picco viene effettuato principalmente mediante il metodo spettrofotometrico ad una lunghezza d'onda di 190-220 nm, sono descritti anche i metodi fluorimetrici [103].

L'analisi della sostanza e le forme di dosaggio finite di insulina utilizzando l'HPLC RP sono descritte in articoli privati ​​nella farmacopea americana ed europea [79,150]. Il metodo viene utilizzato per testare i farmaci del gruppo specificato in termini di "Autenticità dell'insulina", "Proteine ​​correlate", "Determinazione quantitativa" e "Insulina in soluzione".

La letteratura di ricerca descrive anche l'uso della cromatografia a scambio ionico e di affinità per l'analisi dell'insulina [44,102], tuttavia questi metodi non sono stati ampiamente utilizzati nella pratica farmacopea.

La scelta delle condizioni per la determinazione cromatografica della protamina nelle forme di dosaggio di isofano-insulina

Un aumento della resistenza ionica PF porta solitamente ad un aumento dei rapporti di capacità insulinica, che può essere causato da una serie di fattori: - l'aumento della concentrazione di ioni riduce il grado di ionizzazione dei gruppi carichi della molecola proteica, aumentando la sua idrofobicità / - alta concentrazione di cationi contribuisce a gruppi silanol liberi sulla superficie una fase che indebolisce l'interazione elettrostatica non specifica dei gruppi amminici protonati della proteina con la matrice; - l'alta forza ionica influisce sulla struttura spaziale dell'insulina, in conseguenza della quale la superficie disponibile all'interazione con il sorbente cambia. La concentrazione di sali inorganici nella VFS influenza la forma dei picchi e la selettività della separazione di insulina e desamido-Asn-insulina [143,144]. Con eluizione isocratica su LiChrosorb Сів sorbente con una soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (pH 2,3), è stato ottenuto un risultato soddisfacente solo quando il solfato di sodio è stato aggiunto alla soluzione tampone ad una concentrazione di 0,1 M. La maggior parte dei metodi di analisi dell'insulina inclusi negli articoli farmacopea e ND, utilizzare PF sulla base di soluzioni tampone con un contenuto di solfato di sodio pari a 0,2 M. Un contenuto così elevato di solfato di sodio influenza negativamente la riproducibilità dei risultati cromatografici a causa della stratificazione degli eluenti, inoltre, soluzioni saline altamente concentrate hanno un effetto negativo sulle apparecchiature cromatografiche, riducendone la durata. Considerando che i metodi di analisi farmacologica sono stati sviluppati più di 20 anni fa, è sembrato interessante studiare il comportamento cromatografico dell'insulina sotto OF-HPLC sui sorbenti cromatografici di ultima generazione, a seconda della concentrazione di solfato di sodio. Allo stesso tempo, hanno cercato di scoprire se una riduzione del contenuto di solfato di sodio in PF è ammissibile senza un significativo deterioramento della capacità di separazione del sistema cromatografico. Come risultato della ricerca è emerso che l'effetto della concentrazione di solfato di sodio nel PF è diverso, a seconda del tipo di fase innestata, nonché della specie di insulina. Sui sorbenti con gruppi innestati C4 e C la selettività della separazione dei picchi di insulina umana e desamido-Asn-insulina umana non dipende dalla concentrazione di solfato di sodio in. soluzione tampone1 nell'intervallo da 0,05 M a 0,2 M. Sul sorbente Diaspher-110-C18, la selettività di separazione di questa coppia di picchi ha un massimo a 0,05 M e un minimo a 0,1 M (grafico 4). D'altra parte, la selettività della separazione delle specie animali di insulina e le loro corrispondenti forme AsnA21 desamidate non dipende dalla forza ionica della soluzione quando è separata su un assorbente Diaspher-110-C18. Su un sorbente con gruppi innestati con C8, la selettività aumenta da 1,25 a 1,28 con un aumento della concentrazione di solfato di sodio (figura 4). Su un sorbente con gruppi C4 innestati, la selettività della separazione nel caso dell'insulina di manzo è massima a 0,1 M di solfato di sodio e minimo a 0,2 M. Per l'insulina di maiale, non c'è un massimo pronunciato a una concentrazione di solfato di sodio di 0,1 M, in questo caso un aumento di ioni le forze hanno portato ad una diminuzione della selettività della separazione (figura 4). Il numero di piastre teoriche efficaci aumenta con l'aumentare della concentrazione di solfato di sodio. L'eccezione è il comportamento dell'insulina umana sul sorbente Diasfer-110-C8 (figura 5). Il grado di separazione dei picchi di insulina e desamido-Asn-insulina aumenta con un aumento della forza ionica delle FS, indipendentemente dalla specie di insulina e dal tipo di fase dell'innesto (diagramma b). Riducendo la concentrazione di solfato di sodio da 0,2 M a 0,1 M, il grado di separazione della coppia selezionata di picchi diminuisce in media del 5% per le insuline umane e suine e del 10% per l'insulina di manzo. Tenendo conto del fatto che il valore assoluto del grado di separazione supera 2.0, il deterioramento misurato nella capacità di separazione della colonna, a nostro avviso, non è significativo. Di conseguenza, la concentrazione di solfato di sodio nella soluzione tampone PF può essere ridotta di 2 volte rispetto ai metodi di analisi farmacopea.

Nella maggior parte degli studi sull'analisi di proteine ​​e peptidi, la separazione viene effettuata a temperatura ambiente. Inoltre, alcuni autori indicano che l'effetto della temperatura sulla selettività della separazione è minimo [48]. Tuttavia, con l'aumentare della temperatura, il processo di scambio di massa tra le fasi stazionarie e mobili viene accelerato, il che porta ad una diminuzione del tempo di ritenzione dei peptidi e al restringimento dei picchi.

Tecnologia dell'insulina

Violazione della secrezione di insulina. L'uso della fotografia affiliata. Schema per l'insulina. Espressione della proinsulina nelle cellule di E. coli. Approcci per risolvere il problema del diabete. Il contributo della biotecnologia alla produzione industriale di ormoni non peptidici.

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MINISTERO DELL'EDUCAZIONE E SCIENZA DELLA REPUBBLICA DEL KAZAKISTAN

KAZAKH AGRO-TECHNICAL UNIVERSITY DENOMINATO DOPO S.SEYFULLIN

Dipartimento di Microbiologia e Biotecnologie

Sulla disciplina "Biotechnology mokroorganizmov"

Sull'argomento: tecnologia per l'insulina

Completato: Myrzabek M? Ldir Kurbanbek? Yzy

Controllato: Akimbaeva A.K. (k. B. N.)

ABBREVIAZIONI E SIMBOLI

1. Storia della scoperta

2. Ottenere l'insulina nelle biotecnologie

3. Modi per ottenere l'insulina umana

4. Espressione della proinsulina nelle cellule di E. coli

5. Purificazione di insulina

6. Dosaggio e somministrazione

In questo corso il lavoro ha usato le seguenti definizioni:

Portatore di proteine ​​- che fornisce il trasporto della proteina ibrida nello spazio periplasmico della cellula o terreno di coltura;

Componente affinità - facilita significativamente la selezione di una proteina ibrida.

L'insulina (dal latino Insula - l'isola) - un ormone peptidico, si forma nelle cellule beta delle isole di Langerhans del pancreas.

Le interleuchine sono un gruppo di citochine sintetizzate principalmente da leucociti (per questo motivo è stata scelta la desinenza "-leukin").

La proinsulina è un precursore dell'insulina sintetizzata dalle cellule B dell'apparato insulare del pancreas.

Cromatografia (chroma greco, chromatos -. La vernice di colore), metodo fisico-chimico per la separazione e l'analisi miscele, basato sulla distribuzione di componenti tra due fasi - mobile (eluente) fisso e fluisce attraverso il fermo.

Incapsulamento - un meccanismo del linguaggio di programmazione che limita l'accesso ai componenti che compongono un oggetto (metodi e proprietà), li rende privati, cioè accessibili solo all'interno di un oggetto.

Una proteina di fusione (fusionprotein, anche una proteina composta chimerica) è una proteina ottenuta combinando due o più geni che originariamente codificavano proteine ​​separate.

Gli ormoni (dal greco Hormao - mettono in moto, inducono), gli ormoni, le sostanze biologicamente attive prodotte dalle ghiandole endocrine o dalle ghiandole endocrine e secrete da loro direttamente nel sangue.

Il diabete mellito è un gruppo di malattie endocrine, che si sviluppa a causa dell'insufficienza assoluta o relativa dell'insulina ormonale.

Incapsulamento - un meccanismo del linguaggio di programmazione che limita l'accesso ai componenti che compongono un oggetto (metodi e proprietà), li rende privati, cioè accessibili solo all'interno di un oggetto.

La somatostatina è un ormone delle cellule delta delle isole pancreatiche di Langerhans, nonché uno degli ormoni dell'ipotalamo.

Radioimmunologico - Metodo di determinazione quantitativa di sostanze biologicamente attive in fluidi biologici, basato sul legame competitivo del radionuclide sostanza marcata stabile e simili desiderato vincolante ai sistemi specifici (ormoni, enzimi, farmaci e altri.).

ABBREVIAZIONI E SIMBOLI

HPLC - Cromatografia liquida ad alta prestazione

cDNA - acido desossiribonucleico complementare

La funzione principale dell'insulina è di assicurare la permeabilità delle membrane cellulari per le molecole di glucosio. In forma semplificata, si può affermare che non solo carboidrati, ma anche qualsiasi nutrienti, infine spaccati al glucosio, che viene utilizzato per la sintesi di altre molecole contenenti carbonio, ed è l'unico tipo di centrali elettriche fuel cell - mitocondri. Senza l'insulina, la permeabilità della membrana cellulare al glucosio scende di 20 volte e le cellule muoiono per fame e lo zucchero in eccesso disciolto nel sangue avvelena il corpo.

Insufficienza della secrezione di insulina dovuta alla distruzione delle cellule beta - carenza assoluta di insulina - è un elemento chiave nella patogenesi del diabete mellito di tipo 1. La violazione dell'effetto dell'insulina sul tessuto - deficienza di insulina relativa - occupa un posto importante nello sviluppo del diabete di tipo 2.

L'uso della cromatografia di affinità ha ridotto significativamente il contenuto di proteine ​​contaminanti nella preparazione con un peso molecolare più elevato rispetto all'insulina. Tali proteine ​​includono proinsulina e proinsuline parzialmente scisse, che sono in grado di indurre la produzione di anticorpi anti-insulina.

L'uso dell'insulina umana sin dall'inizio della terapia riduce al minimo l'insorgenza di reazioni allergiche. L'insulina umana viene assorbita più velocemente e, indipendentemente dalla forma del farmaco, ha una durata d'azione più breve dell'insulina animale. Le insuline umane sono meno immunizzate rispetto al maiale, in particolare le insuline miste di bovini e suini.

Lo scopo di questo corso è di studiare la tecnologia dell'insulina. Per raggiungere i seguenti obiettivi sono stati fissati:

1. ottenere l'insulina nelle biotecnologie

2. Modi per ottenere l'insulina

H. Purificazione dell'insulina

La storia della scoperta di insulina è associata al nome del medico russo I.M. Sobolev (seconda metà del 19 ° secolo), che ha dimostrato che il livello di zucchero nel sangue umano è regolato da uno speciale ormone del pancreas.

Nel 1922, l'insulina estratta dal pancreas di un animale, è stato introdotto ragazzo di dieci anni con il diabete risultano superato tutte le aspettative, e un anno dopo la società americana «Eli Lilly» ha pubblicato i primi prodotti di insulina animale.

Dopo aver ricevuto il primo lotto industriale di insulina nei prossimi anni, è stato attraversato un modo enorme di isolamento e purificazione. Di conseguenza, l'ormone è diventato disponibile per i pazienti con diabete di tipo 1.

Nel 1935, il ricercatore danese Hagedorn ottimizzò l'azione dell'insulina nel corpo proponendo un farmaco prolungato.

I primi cristalli di insulina furono ottenuti nel 1952 e nel 1954 il biochimico inglese G. Senger decifrò la struttura dell'insulina. Lo sviluppo di metodi per la purificazione dell'ormone da altre sostanze ormonali e prodotti di degradazione dell'insulina ha permesso di ottenere insulina omogenea, chiamata insulina monocomponente.

Nei primi anni '70. Gli scienziati sovietici A. Yudaev e S. Shvachkin hanno proposto la sintesi chimica dell'insulina, tuttavia l'implementazione di questa sintesi su scala industriale era costosa e non redditizia.

In futuro, vi è stato un progressivo miglioramento del grado di purificazione delle insuline, che ha ridotto i problemi causati da allergie all'insulina, compromissione della funzionalità renale, deficit visivo e resistenza all'insulina immune. L'ormone più efficace era necessario per la terapia sostitutiva nel diabete mellito: insulina omologa, cioè insulina umana.

In 80 anni i progressi nella biologia molecolare hanno permesso sintetizzato usando E.coli entrambe le catene di insulina umana, che sono stati poi collegati ad una molecola biologicamente attiva, un ormone, e l'Istituto di Chimica Bioorganica insulina ricombinante preparati utilizzando ceppi di E. coli geneticamente ingegnerizzati.

2. Ottenere l'insulina nelle biotecnologie

L'insulina, un ormone peptidico delle isole pancreatiche di Langerhans, è il principale trattamento per il diabete mellito. Questa malattia è causata da una carenza di insulina e si manifesta con un aumento dei livelli di glucosio nel sangue. Fino a poco tempo fa, l'insulina è stata ottenuta dal pancreas di un toro e di un maiale. Il farmaco differiva dalle sostituzioni di insulina 1-3 di insulina umana, quindi c'era una minaccia di reazioni allergiche, specialmente nei bambini. L'uso terapeutico su larga scala di insulina è stato limitato dal suo alto costo e risorse limitate. Con la modifica chimica, l'insulina degli animali è stata resa indistinguibile dall'uomo, ma ciò ha comportato un ulteriore aumento del costo del prodotto. [1]

Dal 1982, Eli Lilly produce insulina geneticamente modificata basata sulla sintesi separata di E. colie e catene B. Il costo del prodotto è diminuito in modo significativo, l'insulina prodotta è identica all'uomo. Dal 1980, sono stati riportati nella stampa la clonazione del gene della proinsulina, un precursore dell'ormone, che passa in una forma matura con proteolisi limitata.

La tecnologia dell'incapsulamento è anche legata al trattamento del diabete: le cellule pancreatiche in una capsula, introdotte una volta nel corpo del paziente, producono insulina entro un anno.

Integrated Genetics ha lanciato la produzione di ormoni follicolo-stimolanti e luteinizzanti. Questi peptidi sono composti da due subunità. All'ordine del giorno c'è la questione della sintesi industriale degli ormoni oligopeptidici del sistema nervoso, le ankefaline, costituite da 5 residui di amminoacidi, e le endorfine, gli analoghi della morfina. Con l'uso razionale di questi peptidi alleviare il dolore, creare un buon umore, aumentare l'efficienza, concentrare l'attenzione, migliorare la memoria, mettere in ordine il sonno e la veglia. Un esempio della valida applicazione dei metodi di ingegneria genetica è la sintesi di β-endorfina che utilizza la tecnologia delle proteine ​​ibride descritta sopra per un altro ormone peptidico, la somatostatina [2].

3. Modi per ottenere l'insulina umana

Storicamente, il primo modo per ottenere l'insulina a fini terapeutici è quello di isolare gli analoghi di questo ormone da fonti naturali (isole pancreatiche di bovini e suini). Negli anni '20 del secolo scorso, è stato scoperto che le insuline bovine e suine (che sono più vicine all'insulina umana nella struttura e nella sequenza di amminoacidi) mostrano un'attività nel corpo umano paragonabile all'insulina umana. Successivamente, l'insulina bovina o suina è stata usata a lungo per il trattamento di pazienti con diabete di tipo 1. Tuttavia, dopo un po 'di tempo, è stato dimostrato che in alcuni casi gli anticorpi anti-insulina bovina e suina iniziano ad accumularsi nel corpo umano, annullando in tal modo i loro effetti.

D'altra parte, un vantaggio di questo metodo è la disponibilità di materie prime che producono insulina (bovini e insulina suina può essere facilmente ottenuto in grandi quantità), che ha svolto un ruolo fondamentale nello sviluppo del primo metodo per la produzione di insulina umana. Questo metodo è chiamato semi-sintetico [3].

In questo metodo di produzione di insulina umana, l'insulina suina è stata utilizzata come materia prima. L'insulina suina purificata è stata scissa dall'ottapeptide C-terminale della catena B, dopo di che l'ottapeptide C-terminale dell'insulina umana è stato sintetizzato. Quindi è stato attaccato chimicamente, i gruppi protettivi sono stati rimossi e l'insulina ottenuta è stata purificata. Quando si testava questo metodo per ottenere insulina, veniva mostrata l'identità completa dell'ormone ottenuto con l'insulina umana. Il principale svantaggio di questo metodo è l'alto costo dell'insulina risultante (anche ora la sintesi chimica dell'ottapeptide è costosa, specialmente su scala industriale).

Attualmente, l'insulina umana si ottiene principalmente in due modi: modificando l'insulina di maiale con un metodo enzimatico sintetico e con un metodo di ingegneria genetica.

Nel primo caso, il metodo si basa sul fatto che l'insulina suina si differenzia dall'insulina umana per una singola sostituzione al terminale C della catena B Ala30Thr. La sostituzione di alanina con treonina viene effettuata mediante la scissione catalizzata da enzima di alanina e, invece, attaccando un residuo di treonina protetto da carbossi presente nella miscela di reazione in un grande eccesso. Dopo la scissione del gruppo protettivo O-tert-butile, si ottiene l'insulina umana. (immagine 1)

Figura 1 - Schema dei metodi per la produzione di insulina umana

L'insulina è stata la prima proteina ottenuta per scopi commerciali utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante. Esistono due approcci principali per ottenere l'insulina umana geneticamente modificata. Nel primo caso, separati (diversi ceppi produttori) producono entrambe le catene seguite dalla piegatura della molecola (la formazione di ponti disolfuro) e dalla separazione della misoforma. Nel secondo, la preparazione sotto forma di un precursore (proinsulina) seguita dalla scissione enzimatica con tripsina e carbossipeptidasi. Nella forma attiva dell'ormone. La più preferibile attualmente è la produzione di insulina come precursore, garantendo la corretta chiusura dei ponti disolfuro (nel caso di produzione separata di catene, si effettuano cicli consecutivi di denaturazione, separazione della misoforma e rinaturazione [3].

In entrambi gli approcci, è possibile sia individualmente ottenere i componenti di partenza (catene A e B o proinsulina), sia come parte delle proteine ​​ibride. Oltre alle catene A e B o alla proinsulina, nella composizione delle proteine ​​ibride possono essere presenti:

1) proteina portatrice - garantendo il trasporto della proteina ibrida nello spazio periplasmico della cellula o terreno di coltura;

2) componente di affinità - facilita significativamente la selezione di una proteina ibrida.

Allo stesso tempo, entrambi questi componenti possono essere presenti simultaneamente nella composizione della proteina ibrida. Inoltre, quando si creano proteine ​​ibride, è possibile utilizzare il principio della multidimensionalità (cioè, sono presenti diverse copie del polipeptide target nella proteina ibrida), il che rende possibile aumentare significativamente la resa del prodotto target [4].

Abbiamo usato il ceppo JM 109 N1864 con una sequenza nucleotidica incorporata in un plasmide che esprime una proteina ibrida, che consiste in proinsulina lineare e un frammento di frammento di proteina Astaphylococcusaureus collegato al suo N-terminale attraverso un residuo di metionina. La coltivazione della biomassa satura di cellule del ceppo ricombinante assicura l'inizio della produzione della proteina ibrida, l'isolamento e la trasformazione sequenziale di cui l'intube porta all'insulina. Un altro gruppo di ricercatori ha ricevuto nel sistema di espressione batterica una proteina ricombinante di fusione costituita da proinsulina umana e una coda di polihistidina collegata ad esso tramite un residuo di metionina. È stato isolato mediante cromatografia chelata su colonne di Ni-agarosio da corpi di inclusione ed è stato digerito con bromuro di cianogeno. Gli autori hanno determinato che la proteina isolata è S-solforata. L'analisi di mappatura e spettrometria di massa della proinsulina ottenuta, purificata mediante cromatografia a scambio ionico su resina a scambio anionico e HPLC (fase inversa) HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni), ha mostrato la presenza di ponti disolfuro corrispondenti ai ponti disolfuro di proinsulina umana nativa. Ha inoltre riferito sullo sviluppo di un nuovo metodo migliorato per l'ottenimento di insulina umana mediante metodi di ingegneria genetica in cellule procariotiche. Gli autori hanno scoperto che l'insulina ottenuta nella sua struttura e attività biologica è identica all'ormone isolato dal pancreas [5].

Recentemente, è stata prestata particolare attenzione alla semplificazione della procedura per la produzione di insulina ricombinante mediante metodi di ingegneria genetica. Pertanto, una proteina di fusione costituita da un peptide leader di interleuchina attaccato all'N-terminale della proinsulina è stata ottenuta tramite un residuo di lisina. La proteina è stata efficacemente espressa e localizzata nei corpi di inclusione. Dopo l'isolamento, la proteina è stata scissa con tripsina per produrre insulina e C-peptide. Un altro gruppo di ricercatori ha agito in modo simile. La proteina di fusione costituita da proinsulina e due domini sintetici di proteina Staphylococcus A, che legano le IgG, era localizzata nei corpi di inclusione, ma aveva un livello più alto di espressione. La proteina è stata isolata mediante cromatografia di affinità utilizzando IgG e trattata con tripsina e carbossipeptidasi B. L'insulina e il C-peptide risultanti sono stati purificati mediante RP-HPLC. Quando si creano strutture di fusione, il rapporto di massa della proteina carrier con il polipeptide target è molto significativo. Questo è il modo in cui viene descritta la struttura dei costrutti di fusione, in cui una proteina che lega l'albumina di siero umano è stata usata come un polipeptide di supporto. Ad essa erano attaccati uno, tre e sette peptidi C. I peptidi C sono stati combinati sulla base della testa-coda utilizzando distanziatori di amminoacidi che trasportano il sito di restrizione Sfi I e due residui di arginina all'inizio e alla fine del distanziatore per la successiva scissione della proteina con tripsina. I prodotti di clivaggio HPLC hanno mostrato che il peptide C viene scisso quantitativamente e ciò consente di utilizzare il metodo dei geni sintetici multimerici per produrre polipeptidi bersaglio su scala industriale.

Ottenimento di proinsulina mutante, che conteneva la sostituzione di Arg32Tyr. Con la scissione articolare di questa proteina con tripsina e carbossipeptidasi B, sono stati formati insulina nativa e C-peptide contenente un residuo di tirosina. Quest'ultimo, dopo l'etichettatura 125I, viene utilizzato attivamente nel dosaggio radioimmunologico [6].

Controllo della qualità dell'insulina

Il contenuto

1. Informazioni generali su come ottenere l'insulina 5

2. Metodi usati per controllare la qualità dell'insulina 8

Riferimenti 17

Estratto dal lavoro

L'1-2% della popolazione europea soffre di diabete e circa il 20% di questi pazienti non può esistere senza iniezioni di insulina. Fin dai primi esperimenti sull'uso di insulina per il trattamento del diabete nel 1922, questo ormone fu isolato dal pancreas degli animali (mucche e maiali). L'insulina animale è leggermente diversa nella sequenza aminoacidica dell'insulina umana.

Le insuline umane e di maiale sono particolarmente vicine: nell'insulina di maiale, la treonina C-terminale della catena B è sostituita da alanina. La mucca e l'insulina umana differiscono in tre residui di amminoacidi. Sono state queste differenze a determinare l'aumentata attività immunogenica dell'insulina bovina rispetto all'insulina di maiale.

Quasi tutti i pazienti trattati con insulina di mucca avevano anticorpi contro l'insulina nel sangue. Le proprietà antigeniche dell'insulina erano anche parzialmente determinate dalle impurità nelle sue preparazioni. Molto probabilmente, è stata la formazione di anticorpi contro l'insulina che ha spiegato alcuni effetti collaterali minori quando si inietta insulina di mucca, per esempio, atrofia del grasso sottocutaneo nel sito di re-iniezione. Nel caso di insulina altamente purificata, questi effetti erano assenti.

Successivamente, grazie all'ingegneria genetica e all'uso di E. Coli, è stata ottenuta l'insulina umana.

L'insulina umana, ottenuta da E. coli, è stata la prima proteina "geneticamente modificata" testata nell'uomo. In esperimenti con volontari sani, è stato riscontrato che è sicuro (non provoca reazioni allergiche e altre reazioni indesiderate) e ha la capacità di ridurre il livello di glucosio nel sangue quando somministrato sotto la pelle o per via endovenosa.

Attualmente, tale insulina umana è ottenuta da molti diabetici in tutto il mondo. Questo è stato preceduto da studi clinici in cui sono stati studiati i cambiamenti metabolici e gli effetti immunologici.

La rilevanza del nostro argomento è che la produzione incontrollata o scarsamente controllata può portare al rilascio di preparati di insulina contaminati, che a loro volta possono portare a conseguenze cliniche avverse.

Lo scopo di questo lavoro è studiare i metodi usati nel controllo di qualità dell'insulina.

riferimenti

GOST R 52249-2004 "Regole per la produzione e il controllo di qualità dei farmaci" 2004

OFS 42-0002-00 "Endotossine batteriche" 2000

OFS 42-0126-09 "Test biologici dell'insulina"

Articolo farmacopea della Federazione Russa FS 42-2620-97. 1997

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Goncharenko G.G. Fondamenti della biotecnologia: metodo di insegnamento. complesso per stud.biolog. spec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 p.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Applicazione del metodo cinetico-cromogenico per la determinazione dell'endotossina batterica (test LAL) nella tecnologia di purificazione dell'insulina umana geneticamente modificata // Rivista biofarmaceutica - 2009. - Vol. 1. - №1. - p. 34-37.